Последовательное фото-отбеливание разграничить отдельные клетки шванновских в нервно-мышечном соединении

Общая цель данного эксперимента заключается в выделении одиночных клеток Швана в нервно-мышечном соединении с помощью конфокальной микроскопии. В этом протоколе используются трансгенные мыши, которые экспрессируют GFP в терминальных и аксональных клетках Швана. Первым делом необходимо расчленить нервную мышцу.

Затем проводится последовательное отбеливание всех швановских клеток, кроме одной, в данном нервно-мышечном соединении, что позволяет выявить морфологию одной клетки. Наконец, создается карта с низким энергопотреблением. Ткань фиксируется и используется для иммуногистохимии для визуализации любого желаемого маркера по отношению к оставшейся неотбеленной шванской клетке.

Результаты показывают морфологию отдельных клеток и, при желании, покадровую микроскопию или иммуногистохимический анализ колокализации в неподвижной ткани на основе конфокальной визуализации. Тем не менее, этот метод может дать представление о морфологии и территории одиночных лебединых клеток в нервно-мышечном соединении. Он также может быть применен к другим системам, таким как клеточные линии, живые срезы мозга или даже другие виды, такие как рыбки данио.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что требуется некоторый опыт, чтобы определить достаточно поверхностное нервно-мышечное соединение и не тратить время на структуры, которые просто не стоят усилий. Поместите 15-сантиметровую чашку для культуры тканей со льдом под микроскоп. Накройте его металлической пластиной.

Поставьте на металлическую пластину 10-сантиметровую чашку для культуры тканей, наполненную раствором Рингера. Поместите камень оксигенации в раствор. Следующим шагом будет выбор мыши, у которой лебединые клетки и аксоны помечены разными цветами.

После того, как мышь была усыплена, распылите на нее этанол Чтобы предотвратить загрязнение шерсти, с помощью больших ножниц сделайте разрез по средней линии над грудиной и два разреза параллельно нижнему краю грудной клетки. Снимите кожу, вскройте брюшную полость и рассеките грудные мышцы разрезами рядом с мышечным прикреплением на грудине. С помощью щипцов удерживайте мечевидный хрящ и разрежьте диафрагму чуть ниже мечевидного хряща.

Рассекайте диафрагму вдоль ее реберных вставок. Время от времени смачивайте ткань раствором Рингера, чтобы предотвратить высыхание, используя щипцы для удержания грудной клетки за счет мечевидного отростка. Начинайте срезать ребра от позвоночного столба как можно ближе к их вставкам.

Левый и правый разрезы должны сходиться выше сердца по направлению к манубриумному кормовому ушку. Старайтесь избегать разрезания крупных кровеносных сосудов, особенно подключичных вен. Для лучшей видимости.

Аккуратно приподнимите препарат, придерживая за мечевидный отросток щипцами. Теперь сделайте поперечный разрез чуть ниже манубриума кормовым ушком, чтобы удалить грудную клетку и переложите Х эксплан в 10-сантиметровую посуду с приготовленным раствором для звона. Поставьте чашку на металлическую тарелку и наполните ее льдом под микроскопом под микроскопом.

С помощью небольших пружинных ножниц удалите остатки тимуса, плевры, диафрагмы и грудных мышц. С помощью маленьких пружинных ножниц отрежьте все ребра, которые не вставляются у грудины. Разрежьте ткань между ребрами.

Это позволяет поместить X explan в 3,5-сантиметровую тарелку с защитным покрытием SIL. Теперь, используя от восьми до 10 укороченных булавок Минучина, зафиксируйте X-образную схему, избегая треугольной кормовой глазной мышцы, указанной здесь. Два штифта должны проходить через хрящевые части грудины, а два штифта должны проходить через более мягкие хрящевые части между ребрами.

Избегайте прокола ребер под треугольной мышцей или рядом с ней. Продолжайте прикалывать, пока ребра не станут немного раздвинуты. Фиксация мышцы в слегка растянутом положении.

Перенесите 3,5-сантиметровую чашку с защитным покрытием порога в конфокальный микроскоп, оснащенный Аргоннским лазером и объективами для погружения в воду. Для покадровой микроскопии вставьте 3,5-сантиметровую чашку с покрытием защиты порога в нагревательное кольцо. Установите систему Superfusion и установите датчик температуры.

Следите за тем, чтобы ничто не касалось эксплантатора, края блюда или сигарного покрытия. Для покадровой микроскопии нагрейте X-explan, но для шван-клетки лучше обесцвечивать комнатной температурой. Теперь с помощью воздушной цели Форекс понаблюдайте за характером иннервации треугольной кормовой глазной мышцы и найдите треугольную полосу кормовой торцевой пластины.

Переключитесь на объектив 20-кратного погружения конуса и начните искать поверхностные области в областях полосы nplate. Расположенные выше ребер и близко к межреберным нервам являются хорошими областями-кандидатами. Переключитесь на объектив 100 x или 60 x для проверки отдельных и mj.

В идеале необходимо найти NMJ, покрытую несколькими швановскими клетками, которые расположены очень поверхностно Решающее значение для успеха этого протокола имеет нахождение их поверхностного и плоского нервно-мышечного соединения. Поскольку нервно-мышечное соединение является инновационным цилиндрическим мышечным слоном, оно имеет тенденцию оборачиваться вокруг волокна, и руки часто не имеют идеального угла для визуализации. Выберите только те нервно-мышечные соединения, которые являются поверхностными, плоскими и находятся на поверхности, используя объектив с числовой апертурой 100 x 1,0.

С помощью зума 2,5 получите конфокальное изображение NMJ. Эти настройки обеспечивают размер пикселя около 0,1 микрометра, обеспечивая правильную пространственную выборку в соответствии с критерием Найквиста. Теперь фотоотбелите шванскую клетку, поместив лазерный луч с яркостью 488 нанометров в центр ядра с максимальной мощностью в течение пяти секунд.

Далее перефокусируйтесь на клетке и оцените результат отбеливания. При необходимости повторите этап обесцвечивания еще раз, пока уровни GFP не снизятся до уровней, близких к фоновым, затем получите еще одно изображение. Очень важно убедиться, что обесцвеченный участок находится вне перекрытия между двумя клетками.

Если есть перекрытие, то обесцвечивание во второй ячейке будет очевидным. При правильном подходе этот подход приводит к четко выявленным конечным клеткам, часто с довольно удивительной морфологией, о которой никто не мог догадаться до начала процедуры. Повторяйте процесс отбеливания до тех пор, пока все клетки швана, кроме одной, не будут обесцвечены.

Последняя неотбеленная шванская клетка подходит для конфокальной покадровой микроскопии. После завершения покадровой съемки сделайте карту этих njs, сделав изображение с 100-кратным увеличением без увеличения, затем сфотографируйте регион с помощью объектива 20-кратного увеличения и повторите процесс с помощью объектива с четырехкратным увеличением. Эта карта необходима для определения njs в соответствии с иммуногистической химией неподвижной мышцы.

После визуализации и отбеливания отсоедините эксплан и переложите его в пробирку объемом 50 миллилитров с содержанием не менее 15 миллилитров 4% PFA. Затем поместите трубку на лед на час после охлаждения ткани в течение часа, промойте ее 0,1 молярного глицина в PBS в течение не менее 10 минут. Затем перенесите неподвижный эксплан в пятисантиметровую чашку для культуры тканей с шелковым покрытием, заполненную 0,01 моляра PBS, и приготовьтесь к дальнейшему препарированию эксплана.

Сначала вырежьте трапециевидную форму с одной стороной, параллельной грудине, а другой через кость к хрящам переходы. Он содержит треугольную мышцу на своей поверхности. Далее удалите нижние ребра с горизонтальным или трансстернальным разрезом, чтобы можно было свободно добраться до зубчатого конца треугольной мышцы.

Теперь введите иглу для подкожных инъекций в качестве булавки в верхнюю часть трапеции. Далее удаляем треугольную мышцу. Во-первых, с помощью щипцов аккуратно удерживайте уголок мышцы.

А во-вторых, используйте шприц и иглу, как микроскальпель, чтобы резать параллельно плоскости грудной стенки. Как только часть мышцы будет освобождена, введите еще одну иглу ниже мышцы через грудную стенку, чтобы обездвижить препарат. Разрезая соединительнотканные вставки, отделите мышцу от грудной клетки, осторожно вытягивая щипцы.

Наконец, удалите жир и остатки кровеносных сосудов с помощью щипцов. Будьте осторожны, чтобы не сорвать нервы. Треугольная мышца теперь готова к иммуногистохимии.

Для визуализации клеток Швана ex vivo был подготовлен треугольный строгий глаз с использованием мышей, экспрессирующих GFP под промотором PLP. Аксоны могут быть одновременно визуализированы путем скрещивания P-L-P-G-F-P с бедром одной OFP трех мышей. С помощью описанного протокола морфология одиночных концевых клеток Швана была выявлена с удивительно высокой детализацией путем отбеливания двух соседних концевых и первых аксональных клеток Швана.

Визуализированные нервно-мышечные соединения были отслежены с использованием заранее созданной карты и отсканированы с высоким разрешением в неподвижной ткани после конфокальной микроскопии в реальном времени, треугольный кормовой эксплан был зафиксирован и окрашен. Здесь показаны ацетилхолиновые рецепторы, помеченные бугало тоином, соединенным с Alexa 6, 47 красного цвета, и синаптические везикулы, помеченные антителом антис-синаптофизина белым. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как визуализировать морфологию отдельных клеток, которые изначально были помечены одним и тем же флуоресцентным белком и упакованы слишком плотно, чтобы раствориться по отдельности.

В нашем примере показано нервно-мышечное соединение, но есть много других потенциальных применений.