Пассирования оттенков эмбриональных стволовых клеток человека линий с Трипсин
12 октября 2006 г.
262.2K просмотров
В этом видео показано, как в нашей лаборатории регулярно проходы оттенки человеческих линий эмбриональных стволовых клеток трипсином.
Это, где вы запустили техники? О, где я вас учил? Белчер.Да.В первый раз, когда я учил тебя, Бел, я провел лето в своем T.Yeah.
И это было похоже на то, что нам там нравились хрящи. И поэтому мне очень понравилась социальная культура там. А потом в Университете Хопкинса, на последнем курсе, я работал с разными проектами, так что мне, как и в инженерии, было гораздо больше о попытках, мы проектируем трехмерное это.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье демонстрируется стандартная методика пассирования линий эмбриональных стволовых клеток человека HuES с использованием трипсина. Правильное пассирование имеет решающее значение для поддержания здоровых, недифференцированных и кариотипически нормальных культур эмбриональных стволовых клеток человека. В протоколе особое внимание уделяется осторожному обращению с клетками для минимизации риска возникновения кариотипических аномалий.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Методы культивирования клеток
- Эмбриональные стволовые клетки человека
Теоретические сведения
- Эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) склонны к приобретению кариотипических аномалий при длительном культивировании.
- Поддержание недифференцированных и генетически стабильных культур hESC имеет важное значение для исследований и терапевтического применения.
- Методы пассирования могут влиять на жизнеспособность клеток и их генетическую стабильность.
- Трипсинизация является общепринятым методом диссоциации и пассирования стволовых клеток.
Цель исследования
- Продемонстрировать стандартизированный протокол пассирования линий эмбриональных стволовых клеток человека HuES с использованием трипсина.
- Осветить этапы, способствующие поддержанию здоровых и кариотипически нормальных культур стволовых клеток.
- Предоставить рекомендации по минимизации риска возникновения генетических аномалий в процессе пассирования.
Используемые методы
- Промывка расширяющихся культур hESC раствором PBS для удаления остатков среды и клеточного детрита.
- Покрытие клеток теплым 0,05% раствором Trypsin-EDTA на время до пяти минут.
- Осторожное отделение клеток с помощью серологической пипетки.
- Сбор и смешивание клеточной суспензии со средой HuES с последующим осторожным центрифугированием.
- Удаление смеси инактивированного трипсина и среды и ресуспендирование клеток в предварительно прогретой среде HuES.
- Расчет подходящего коэффициента пассирования (обычно от 1:10 до 1:20) и высев клеток на монослои фидерных клеток.
- Инкубация свежезасеянных планшетов без беспокойства в течение 48 часов с последующей ежедневной сменой среды.
Основные результаты
- Правильный пассир supporting поддерживает культуру недифференцированных и здоровых клеток HuES.
- Минимизация использования суспензий из одиночных клеток снижает риск возникновения кариотипических аномалий.
- Регулярное использование фидерных слоев и бережное обращение необходимы для обеспечения оптимальных условий культивирования.
- Систематическая замена среды и инкубация без внешних воздействий способствуют восстановлению и росту клеток.
Выводы
- Тщательный пассаж с использованием трипсина имеет решающее значение для сохранения качества линий эмбриональных стволовых клеток человека HuES.
- Избегание избыточного воздействия трипсина и создания суспензий из одиночных клеток помогает поддерживать генетическую стабильность.
- Следование стандартизированным протоколам обеспечивает воспроизводимость и достоверность исследований стволовых клеток.
Часто задаваемые вопросы
Почему при пассировании важно избегать создания суспензии из одиночных клеток?
Создание суспензии одиночных клеток повышает риск возникновения кариотипических аномалий в культурах эмбриональных стволовых клеток человека.
Какое рекомендуемое соотношение при рассаживании клеток HuES?
Рекомендуемое соотношение при пассировании обычно составляет от 1:10 до 1:20, в зависимости от условий культивирования и плотности клеток.
Как долго трипсин должен воздействовать на клетки при пассировании?
Трипсин следует оставить с клетками на время до пяти минут, чтобы осторожно диссоциировать их, избегая избыточного переваривания.
Какой тип фидерных клеток используется для перепосева клеток HuES?
Для поддержки роста клеток HuES используется монослой облученных фибробластов эмбриона мыши в качестве фидерных клеток.
Как часто следует менять среду после пассирования?
После первоначального 48-часового периода покоя среду следует менять ежедневно для поддержания оптимальных условий культивирования.
Почему в данном протоколе используется бережное центрифугирование?
Щадящее центрифугирование помогает собрать клетки, не вызывая механического стресса или повреждений, что позволяет сохранить жизнеспособность и качество клеток.
Практическая значимость для промышленности
Надежное пассирование линий эмбриональных стволовых клеток человека HuES является основой для поддержания недифференцированных, кариотипически нормальных культур, что критически важно для ранних этапов открытий и трансляционных исследований. Стандартизированные методы работы сводят к минимуму генетический дрейф и обеспечивают воспроизводимость в рамках программ НИОКР. Данный протокол обеспечивает целостность релевантных моделям заболеваний стволовых клеток, используемых при валидации мишеней и в доклинических рабочих процессах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет получать стабильные популяции недифференцированных стволовых клеток для исследований, основанных на проверке гипотез.
- Снижает риск возникновения кариотипических аномалий, которые могут исказить данные по валидации мишени.
- Обеспечивает прогностическую достоверность последующих функциональных анализов и изучения сигнальных путей.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение воспроизводимых популяций клеток для стандартизации анализов и проведения скрининговых кампаний.
- Облегчает подготовку валидированных биологических систем для оценки соединений.
- Гарантирует масштабируемость и стабильность для обеспечения готовности к высокопроизводительному скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Поддерживает генетическую стабильность, необходимую для непрерывности использования моделей, релевантных для изучения заболеваний.
- Обеспечивает соответствие исследованиям трансляционных биомаркеров за счет сохранения аутентичности клеточных линий.
- Позволяет осуществлять риск-ориентированное развитие доклинических моделей на основе стволовых клеток.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный протокол пассирования разработан для этапа перехода от ранних открытий к разработке доклинических моделей, обеспечивая преемственность и надежность данных от начального расширения популяции клеток до углубленных функциональных исследований.
- Биология открытий: Поддержание недифференцированных, генетически стабильных культур стволовых клеток для надежной проверки гипотез.
- Скрининг: Предоставление воспроизводимых, валидированных популяций клеток для разработки анализов и рабочих процессов скрининга.
- Аналитика: Обеспечение количественной оценки жизнеспособности клеток и кариотипической целостности в течение нескольких пассажей.
- Трансляционные исследования: Сохранение точности модели для последующих исследований биомаркеров и значимости заболевания.
- Корпоративное использование: Создание стандартизированного, многократно используемого протокола культивирования стволовых клеток для различных групп R&D.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях на основе стволовых клеток.
- Операционная ценность: Способствует стандартизации, воспроизводимости и масштабируемости рабочих процессов культивирования стволовых клеток.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о целесообразности продолжения проекта (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию и развитие моделей, полученных из стволовых клеток, с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт культивирования и работы со стволовыми клетками во избежание избыточной трипсинизации.
- Необходим доступ к контролируемым инкубаторам, центрифугам и инфраструктуре для подготовки фидерных клеток.
- Требуется строгое соблюдение всеми членами команды стандартизированных интервалов пассажа и коэффициентов разделения.
- При переходе между различными линиями стволовых клеток или фидерными системами необходима тщательная адаптация протокола.
- Ограничения включают риск кариотипического дрифта при создании суспензий из отдельных клеток или при нестрогом соблюдении этапов протокола.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Почему проверка нулевой гипотезы важна для оценки кариотипической стабильности?
Проверка нулевой гипотезы позволяет объективно оценить, являются ли наблюдаемые кариотипические изменения в культурах HuES статистически значимыми, что обеспечивает достоверную валидацию мишени и минимизирует количество ложноположительных результатов на ранних этапах поиска.
Как изоляция независимой переменной вписывается в рабочие процессы пассирования HuES?
Изоляция таких переменных, как время воздействия трипсина и коэффициент разделения, позволяет отнести изменения в состоянии клеток или кариотипе к конкретным этапам протокола, что способствует более эффективному устранению механистических рисков и оптимизации рабочего процесса.
Что позволяют количественные измерения зависимых переменных при пассировании стволовых клеток?
Количественная оценка жизнеспособности клеток, их недифференцированного состояния и кариотипической целостности позволяет проводить воспроизводимый бенчмаркинг и перекрестное сравнение условий культивирования, что способствует надежной разработке и скринингу анализов.
Почему требования к воспроизводимости имеют критическое значение для кросс-функциональных групп по исследованию стволовых клеток?
Репликация гарантирует, что наблюдаемые результаты, такие как сохранение недифференцированного состояния или генетическая стабильность, остаются неизменными независимо от оператора и лаборатории, что способствует надежному обмену данными и принятию совместных решений в области исследований и разработок.
Какие возможности статистического анализа необходимы перед внедрением новых протоколов пассирования?
Команды должны иметь возможность проводить статистический анализ состояния клеток, статуса дифференцировки и кариотипических данных для подтверждения изменений в протоколе, чтобы гарантировать, что новые рабочие процессы сохраняют или повышают качество и воспроизводимость культуры.
