Волоконно-оптические имплантации для хронической стимуляции Optogenetic ткани головного мозга

Целью данного эксперимента является активация и долгосрочное изучение нейронных цепей у бодрствующих мышей. Этот метод основан на концепции, первоначально описанной в Sparta etal. Это достигается путем предварительной сборки шнура оптоволоконной пары, который соединяет оптическое вращающееся соединение с волоконно-оптическим имплантатом.

Затем волоконно-оптический кабель имплантируется в интересующую ткань мозга, чтобы создать проход для прохождения света непосредственно к каналу редина, экспрессирующему нейроны. Наконец, источник света подключается к оптическому вращающемуся шарниру, чтобы создать последовательно соединенный путь от источника света к тканям мозга. В конечном счете, индуцированное светом возбуждение нейронов, экспрессирующих красный канал, может быть оценено на основе исследований in vivo, электрофизиологии и поведения.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как направляющие канюли, заключается в том, что она сводит к минимуму повреждение тканей мозга, вызванное повторным введением и удалением оптического волокна. Хотя этот метод может дать представление о функции нейронных цепей, он также может быть применен к другим системам, чтобы лучше понять синапсы и схемозависимые механизмы, лежащие в основе определенных типов неврологических расстройств. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение.

Поскольку этапы имплантации сложны в освоении, каждый, казалось бы, незначительный шаг вносит большой вклад в общую стабильность и надежность метода. Начните с резки 35 миллиметров оптоволокна диаметром 125 микрон с сердечником 100 микрон, расположив твердосплавный наконечник перпендикулярно оптоволокну и надрез волокна одним однонаправленным движением с последующим вытягиванием. Теперь вставьте lc ceramic feral с отверстием диаметром 127 микрон выпуклой стороной вниз в тиски, а затем вставьте волоконно-оптический кусок в feral.

Оптоволоконный кабель должен скользить плавно и незначительно выступать за выпуклый конец дикого конца. Затем нанесите одну каплю свежеприготовленной термоотверждаемой оптоволоконной эпоксидной смолы на плоский конец фералки, а затем приложите к эпоксидной смоле термопушку. Эпоксидная смола должна заполнять дикую смолу, так как она нагревается и отверждается, когда становится черной.

После отверждения очистите всю эпоксидную смолу с боковых сторон ферала, затем с помощью волоконно-оптического полировального диска lc сделайте круговые вращательные узоры для полировки выпуклого конца ферала на листах из оксида алюминия на полировальной губке на четырех убывающих степенях. Затем разрежьте оптоволокно на плоском конце до нужной длины для нацеливания на интересующую область. Чтобы проверить полированную волоконную оптику, вставьте полированный конец имплантата в втулку муфты.

До тех пор, пока не будет ощущаться прямой контакт с противоположным диким, плохой имплантат будет иметь слабую фокальную точку возле кончика волоконной оптики, в то время как хороший имплантат будет пропускать гладкий концентрический круг света без выхода. Мощности до 10 милливатт сохраняют готовые имплантаты в пене до момента использования. Начните этот шаг с измерения, а затем заселения оптоволокна диаметром 220 микрон с сердечником 200 микрон, чтобы мышь могла свободно двигаться, но не позволяла ей грызть волокно.

Затем вставьте оптоволоконный кабель в кусок фурационной трубки с внутренним диаметром немного больше и длиной немного меньше, чем у оптоволокна. Теперь отрежьте около 25 миллиметров от одного конца оптоволокна и вставьте его в металлический конец многомодовой сборки FC MM feral. При диаметре отверстия 230 микрон до упора оптоволоконная трубка должна торчать через дикий конец.

Затем закрепите соединение цианоакрилатом на металлическом конце и закройте соединение разъемом Отполируйте дикий конец ботинком с помощью полировального диска FC, как только что показано. После зачистки другого конца волоконной оптики вставьте его в LC ceramic feral только с выпуклым дистальным концом. Затем нанесите каплю эпоксидной смолы на плоский конец и нагрейте до полного отверждения, как только что показано.

После полировки выпуклого конца дикого животного, как показано только что на рисунке, наденьте рукав lc feral на выпуклый конец дикого животного, пока он не достигнет середины рукава. Затем поместите термоусадочную трубку на трубку и втулку и нагрейте термоусадочную трубку, чтобы надежно и надежно защитить соединение. Наконец, подключите feral к лазерному источнику, а затем проверьте его, измерив светоотдачу через соединитель с помощью спектрофотометра, потери света между выходом лазера и измеренной выходной мощностью соединителя не должны превышать 30% перед началом операции.

Продезинфицируйте операционную область профильным спиртом изопа с последующим нанесением раствора хлоргексидина. Затем поместите мышь в стереотаксическую установку и закрепите голову, убедившись, что череп находится на одном уровне. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза животного, чтобы предотвратить сухость и послеоперационные боли.

Теперь сделайте разрез по средней линии кожи головы, чтобы обнажить черепную коробку от глазных орбит до лямбда-шва. Используйте серафиновые зажимы, чтобы удерживать кожу и поддерживать доступ к черепной коробке. Затем с помощью зубочистки вытравите клетчатый узор по всей поверхности черепа.

Образовавшийся мусор смыть стерильным физиологическим раствором. После тщательного высыхания с помощью ватного тампона нанесите 3% перекись водорода на открытый череп примерно на две-три секунды, чтобы создать микропоры. Затем многократно промойте череп более стерильным физиологическим раствором и тщательно просушите его.

После травления, промывки и сушки шахматного рисунка в черепную коробку, снова вставьте волоконно-оптический феральный имплантат в держатель зонда, а затем подключите его к стереотаксическому кронштейну. Определите местоположение дыры с помощью стереотаксического атласа, откалиброванного по bgma и lambda. Затем с помощью ротационной бормашины сделайте небольшую трепанацию зубов диаметром менее одного миллиметра над интересующей областью, стараясь не сломать твердую мозговую оболочку и не повредить ткани.

Используя стереотаксическое положение руки при размещении имплантата непосредственно над исследуемой областью, животное должно опираться на окружающие ткани черепа. Теперь с помощью стерильной зубочистки нанесите тонкий ровный слой свежеприготовленного стоматологического цемента на череп и на нижнюю часть имплантата. Стараясь не соприкасаться с кожей животного, базовый слой стоматологического цемента должен покрывать как можно большую площадь поверхности черепа.

Самым сложным аспектом этой процедуры является нанесение стоматологического цемента без его соприкосновения с массой кожи. Чтобы обеспечить успех, наносите небольшое количество цемента за один раз тонкими слоями и дождитесь полного высыхания каждого слоя, прежде чем добавлять следующий. Нанесите ровные слои стоматологического цемента, чтобы сформировать небольшой холмик на верхней части черепа и вокруг имплантата.

Оставьте три-пять миллиметров выпуклого конца дикого слоя чистым от цемента, чтобы обеспечить плавное беспрепятственное соединение. Затем зашить волосистую часть головы над холмиком стоматологического цемента и вокруг имплантата можно использовать клей для дополнительного связывания после наложения швов. Наконец, нанесите местные анальгетики и антибиотики на кожу шва и вокруг основания имплантата, а затем поместите мышь в клетку для послеоперационного восстановления.

Правильная сборка волоконно-оптического имплантата и соединителя приводит к минимальным потерям фотонов между источником света и концом оптоволокна в исследуемой области. В то время как полированная волоконная оптика должна пропускать свет по равномерному концентрическому кругу, подобному показанному здесь кругу, как видно на этом изображении при тщательной имплантации и наложении швов, имплантат не вызывает видимого раздражения у мыши и может оставаться на месте для длительных исследований без какого-либо значительного ухудшения качества волоконной оптики или количества пропускаемого света. Через оптоволоконный кабель имплантируется над моторной корой, о чем свидетельствуют данные видео об электрофизиологии in vivo, показывающие активацию целевых нейронов через имплантат и поведенческую реакцию животного во время стимуляции мозга. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как фотостимуляция целевых областей мозга, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, каковы паттерны связи цепей, связанные с клетками-мишенями?

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как собирать волоконно-оптические имплантаты и соединительные шнуры, а также как имплантировать их поверх мозговой ткани, экспрессирующей оптогенетические портеры.