Обработка по правам Маммопластика сокращении и Мастэктомия тканей для культуры клеток

Этот протокол направлен на изоляцию эпителиальных частей молочной железы, свободных от ассоциированных стромальных клеток молочной железы. Начните с накопленного препарирования хирургического материала для обогащения эпителиальных структур с помощью ферментативного пищеварения. Отделите эпителиальные органоиды от стромального материала за пределами базальной мембраны.

Затем обрабатывайте расщепленные органоиды через клеточные сетчатые фильтры с фиксированным размером пор для получения обогащенных фракций. Засейте органоиды для немедленного выращивания или заморозьте запасы для будущего использования. В конечном счете, эпителиальные органоиды используются для создания долговременных культур нормальных эпителиальных клеток молочной железы человека.

Впервые я разработал этот метод в конце 1970-х годов, чтобы продвинуть вперед в области биологии эпителиальных клеток человека и канцерогенеза. Было доступно большое количество хирургического материала для отбрасывания из нормальных тканей человеческой памяти. Что было необходимо, так это метод обработки этого объемного гетерогенного материала, чтобы сделать его пригодным для культуры чистых эпителиальных клеток и сред для поддержки долгосрочного роста.

Визуальная демонстрация этого метода полезна, особенно для того, чтобы узнать, как проводить грубое вскрытие. Как выглядят правильно переваренные органоиды? Фильтрация органоидов и покрытие органоидов для культивирования.

Преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает чистые эпителиальные фракции для стромы, а эпителиальные клетки остаются неповрежденными. Органоиды, которые мы нашли, дают наилучший начальный рост и максимизируют количество клеток, которые могут быть получены. Двое ученых из Национальной лаборатории имени Лоуренса в Беркли, Джеймс Гарви и Марк ЛеБарж, теперь продемонстрируют эту процедуру из отброшенного материала хирургических процедур.

Получите ткань молочной железы человека в стерильных контейнерах, содержащих буфер или полную среду плюс антибиотики при температуре четыре градуса Цельсия. Нарежьте кусочки ткани и поместите их в большую стеклянную стерильную посуду. Отделите эпителиальные участки от стромального матрикса жировой ткани, соединительной ткани и кровеносных сосудов.

Аккуратно рассеките белые пряди эпителиальных участков, встроенных в более желтый стромальный матрикс. Удерживайте материал щипцами и соскребите грубо жировой материал скальпелем. Затем с помощью противоположных скальпелей разрежьте эпителиальную ткань примерно на четыре миллиметра, чтобы облегчить пищеварение.

Переложите рассеченную эпителиальную ткань в коническую центрифужную пробирку объемом 50 или 15 миллилитров В сильно волокнистой ткани. Будет больше твердого белого неэпителиального материала. Если трудно препарировать эпителиальные клетки из таких волокнистых матриц.

Ткань можно разрезать на квадратные кусочки площадью от одного до трех миллиметров и переваривать отдельно. Наполните пробирку питательной средой, содержащей сырую коллагеназу и высококалорийные дни, оставив небольшое воздушное пространство для смешивания во время вращения. Инкубируйте образец в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия на вращателе на 360 градусов при восьми оборотах в минуту после сбраживания.

Гранулируйте образцы центрифугированием по 600 г в течение пяти минут. Откажитесь от надосадочной жидкости, жира и среды, следуя рекомендациям учреждения по утилизации тканей человека. Чтобы контролировать переваривание тканей, разведите небольшое количество гранул в среду и исследуйте под микроскопом полностью переваренные органоиды, которые выявят прикрепленные стромы.

Повторяйте ферментативное расщепление до тех пор, пока ткань полностью не расщепится в чистые органоиды. Если необходимо второе ночное пищеварение, концентрацию ферментов может потребоваться снизить, чтобы предотвратить переваривание. Правильно переваренные органоиды покажут гладкие протоковые альвеолярные или протоковые альвеолярные структуры, свободные от прикрепленной стромы.

Когда переваривание завершено, ресуспендию в окончательную гранулу вводят в среднее место антибиотики. Пропустите переваренный образец в кватах через стерильное ситечко 100 микрон над стерильной пробиркой объемом 50 миллилитров. После того, как среда стечет в трубку, промойте органоиды тремя миллилитрами среды.

Повторяйте до тех пор, пока не будет перенесена вся ресуспендированная гранула. Затем осторожно переверните фильтр над стерильной трубкой и промойте органоиды в пробирку с большим количеством среды. Это пул органоидов размером 100 микрон.

Теперь пропустите материал, который дренировался в исходную 50-миллилитровую трубку, через 40-микронный фильтр, чтобы отделить альвеолярные структуры от пула фильтратов отдельных клеток и небольших скоплений мезенхимальных и эпителиальных клеток и небольших кусочков сосудистой ткани. Центрифугируйте 100 микрон 40 микрон и фильтруйте бассейны при 600 G в течение пяти минут. Восстановите каждый образец, используя один миллилитр кубических сантиметров в минуту.

Два морозильных раствора на 0,1 миллилитр упакованного вкуса. Держитесь при температуре четыре градуса Цельсия. Аккуратно поместите по 0,1 миллилитра каждого из двух органоидных бассейнов.

Капля за каплей равномерным распределением по одной или 2 35 миллиметровым блюдам. Не царапайте поверхность посуды после нескольких минут после того, как органоиды прикрепятся. Медленно добавляйте питательную среду, чтобы избежать смещения органоидов.

Затем инкубируйте первичные культуры при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном CO2-инкубаторе. Также засемените 0,1 миллилитра пула фильтрата непосредственно на тканевую культуру пластика со средой фибробластов. Инкубируйте первичные культуры при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном CO2-инкубаторе.

Через 24-48 часов проверьте миграцию клеток из органоидов, а через два-три дня следите за митотической культурой. Клетки к ближнему слиянию пополняют среду каждые два-три дня. Небольшие кусочки сосудистой сети могут прикрепляться и приводить к разрастанию клеток фибробластов.

В случаях значительного роста фибробластов. Выполните дифференциальную триппинизацию для удаления фибробластов из больших эпителиальных участков. Промойте клетки один раз в STE-буфере.

Затем добавьте свежих 0,5 миллилитров STE, чтобы просто покрыть блюдо непрерывным микроскопическим наблюдением и легкими, но резкими ударами блюда о твердую поверхность. Ищите отслойку фибробластов, пока эпителиальные клетки еще не адгезивны. Первичные культуры, когда участки эпителиального выроста приближаются к слиянию.

Чтобы сохранить первичную культуру и создать несколько вторичных культур, используйте частичный трипсин. Промойте клетки один раз в буфере STE, затем добавьте свежий STE, чтобы просто накрыть посуду. Следите за тем, чтобы примерно 50% ячеек отсоединились.

Затем добавьте два миллилитра сыворотки, содержащей питательную среду, и соберите клетки. Затем переложите клетки в стерильную 15-миллилитровую пробирку после двух промывок. Пул собранных клеток и культуры Парциализация может быть повторена от четырех до восьми раз с хорошим повторным ростом клеток из первичных чашек и с эквивалентным долгосрочным ростом из субкультуры или замороженных вторичных клеток.

Мы рекомендуем заморозить клетки первой частичной трипсиновой обработки для безопасного хранения и использовать клетки второй ПТ для субкультуры. Когда ткань соответствующим образом переваривается и фильтруется, можно увидеть органоиды, протоковые и альвеолярные структуры с гладкими краями, свободными от прикрепленной стромы. При недостаточном переваривании к нему будет прикреплен материал, а при чрезмерном переваривании края будут шероховатыми, и прикрепление будет менее эффективным после прикрепления органоидов.

Разрастание эпителия начинается в течение 48-72 часов через 48 часов. К 72 часам еще не происходит активного деления клеток с видимым митозом. Митоз должен стать более заметным.

Небольшие кусочки сосудистой сети могут быть источником роста мезенхимальных клеток через четыре дня. Эпителиальные выросты демонстрируют морфологически неоднородные популяции, здесь окрашивание антителами к кератину 14 и кератину 19 отмечает зеленые K 19 положительные люминальные и красные K 14 положительные миоэпителиальные линии, а также желтые K 14 положительные K 19 положительные клетки-предшественники. HMEC можно культивировать в различных средах.

Среды с низким уровнем стресса, такие как М 87а, дополненные холерным токсином и окситоцином, будут поддерживать превосходный долгосрочный рост нормального престазиса HMEC, а также рост нескольких линий HMEC. Результаты анализа фактов иллюстрируют линейное разнообразие у некультивированных органоидов и в четвертом пассе HMEC, культивируемых в среде M 87, A. Здесь люминальные и миоэпителиальные популяции идентифицируются по экспрессии люминальных маркеров EPCA и CD 2 27 и миоэпителиальных маркеров CD 49 F и CD 10 replated.

Четвертый отрывок, HMEC. Факты, обогащенные по предыдущим люминальным и миоэпителиальным маркерам, подтверждаются с помощью иммунофлуоресцентного анализа на кератин К 14 и К 19 HMEC. Культивируемые на пластике до пассажа 4 способны образовывать организованные структуры с in vivo линейными отношениями люминальных и миоэпителиальных клеток, когда их помещают в соответствующие CD 2, 27 и CD 10 используются для обогащения этих двух линий.

ТМК сохраняют свою способность формировать правильную организацию 3D-клеток в микроструктурированных 3D-микроямах с люминальными клетками, находящимися внутри миоэпителиальных клеток. Обогащенные фактами клетки-предшественники также могут образовывать прочные 3D-структуры при нанесении в матригель, имитирующий протоковые и альвеолярные структуры. 3D-структуры в Matrigel также демонстрируют надлежащую 3D-самоорганизацию.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как очистить эпителиальные части молочной железы от связанной с ней молочной стромы. После освоения этой техники можно заниматься в течение двух-трех дней. Техника обработки тканей, как правило, проста.

Важно помнить, что нужно останавливать пищеварение в нужный момент.