Анализируя мышиной сотовых шванновских развития по Растущие аксоны

Целью данного эксперимента является анализ развития шванских клеток вдоль растущих аксонов, их естественной среды обитания. Это достигается путем первого ex explan верхних шейных ганглиев или S cgg эмбрионов мыши на коллагеновые матрицы в качестве второго шага. S-CG лечатся фактором роста нервов или NGF, который способствует росту аксонов из нейронов SCG корональным способом.

В дополнение к росту аксонов из X-эксплана, можно наблюдать эндогенные клетки Швана, мигрирующие вдоль расширенных аксонов к периферии. Развитие клеток Швана может быть проанализировано с помощью покадровой визуализации, а также с помощью анализа конечных точек неподвижной ткани, что позволяет измерять расстояние. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как анализ миграции царапин, заключается в том, что в этот анализ включена естественная среда обитания лебединых клеток.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Поскольку правильная сборка показателей коллагена и правильное препарирование sgs являются ключом к успеху. Эти шаги не особенно сложны для освоения.

Им просто сначала нужна практика. Во время работы в культуре тканей вытяжка понимала наши условия со всеми растворами на льду. Приготовьте исходную питательную среду и коллаген из крысиного хвоста в соответствии с инструкцией в письменном протоколе.

Смешайте 800 микролитров коллагена крысиного хвоста с 210 микролитрами исходной среды. Без внесения пузырьков раствор должен оставаться красного цвета. Если раствор пожелтеет, значит, раствор коллагена Раталь слишком кислый и его нужно переделать с большей концентрацией гидроксида натрия пипеткой на 100 микровыпусков раствора в каждую лунку многолуночного горла и убедиться, что дно каждой лунки полностью покрыто.

Поместите посуду в инкубатор для культуры увлажненных тканей, установленный на 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на два часа. После сбора урожая эмбрионы от Е 16 до Е 18 помещают в чашку Петри, содержащую PBS, затем отделяют от амниона и обезглавливают на уровне кордала ключичной мышцы. Затем области головы и шеи переносят в чашку с силиконовым дном, и во время просмотра через препарирующий микроскоп иглы насекомых используются для закрепления ткани в подчелюстной и ключичной областях.

Теперь с помощью щипцов удаляют кожу и подкожную клетчатку подчелюстной области. Затем удалите подчелюстные слюнные железы, чтобы выявить надподъязычные, подъязычные и грудино-ключично-сосцевидные мышцы. Затем с помощью щипцов осторожно удалите диафрагму hial и грудино-ключично-сосцевидные мышцы, чтобы открыть гортань и трахею.

Захватите трахею щипцами и приподнимите трахею и гортань. После удаления гортани и трахеи видны сонные артерии, которые являются обеими сторонами превертебральных мышц. Верхние шейные ганглии расположены в зоне бифуркации сонных артерий и могут быть идентифицированы как овальная форма.

С помощью щипцов и иглодержателя, прикрепленного к игле от насекомых, удалите верхние шейные ганглии и поместите их в свежую посуду, содержащую PBS, затем рассеките все кровеносные сосуды или соединенные ткани из ганглий. С помощью игл шприца извлеките из инкубатора желатинизированные гели коллагена и с помощью игл шприца, установленных на шприцах, перенесите ганглии на гели. Поместите экспланты в инкубатор для тканевых культур, установленный при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом и влажными условиями на один-два часа.

После одного-двух часов инкубации из инкубатора для культивирования тканей извлекают верхние англиозные ганглии и добавляют 100 микролитров нейробазальной среды, содержащей глютамин и антибиотики с добавкой B 27 и антибиотиками. Впоследствии 200 микролитров нейробазальной среды, содержащей 60 нанограмм на миллилитр. В лунки также добавляется NGF для облегчения роста аксонов.

В это время также могут быть добавлены исследуемые вещества, которые определяются как нулевой день in vitro для изучения влияния на лебединые клетки, которые уже начали мигрировать. Вещества аксонов могут быть введены в течение трех дней in vitro, удалив 180 микролитров существующей среды и заменив ее 200 микролитрами среды, содержащей интересующее вещество, и NGF в удвоенной конечной концентрации. В одном эксперименте рекомендуется использовать многопозиционную настройку в конечной точке эксперимента.

После фиксации эксплантов в предметных стеклах культуры с 4% PFA в течение трех-четырех часов и промывки PBS проводят иммуногистохимию для валидации X-экспланта, поскольку SCG блокируют ткань PBS, содержащей 10% нормальной сыворотки осла и 2% триттона X 100 в течение двух часов. Затем следует первичная инкубация антител в блокирующем растворе на ночь. На следующий день после инкубации первичных антител переложить гели, содержащие X-эксплан, в 24-луночный планшет, после промывки PBS инкубировать с флуоресцентными мечеными вторичными антителами в течение двух часов, находясь в защищенном от света месте, затем промыть PBS и инкубировать с раствором в течение 10 минут.

После нескольких мытья поместите коллагеновые гели, содержащие X-explan, на микроскоп, снимите, высушите предметные стекла и затем закрепите телятиной. Используйте стандартный флуоресцентный микроскоп для получения изображений для последующего количественного анализа. Это полезно, если программное обеспечение микроскопа способно записывать метаданные.

Количественный анализ полученных изображений может быть выполнен с помощью программного обеспечения Фиджи или ImageJ, которое может быть бесплатно использовано для научных целей. В этом фильме показано наращивание аксонов из схематического SCGX EXPLAN в течение четырех дней in vitro. Иммуногистохимический анализ может быть проведен на четвертый день in vitro для четкой идентификации эксплантированного ганглия.

В качестве симпатического ганглия можно наблюдать шванские клетки, мигрирующие вдоль аксона, перемещаясь от верхнего шейного ганглия к периферии. На этом видео показана та же схема миграции, что и при большем увеличении. Расстояния миграции могут быть легко измерены на образцах, противокрасящих ядра с DPI, путем измерения расстояния от ядер ведущих клеток Шван до границы эксплантированных SCG в нескольких местах, как показано на схеме и изображении образца, помеченного DPI, обработанного NGF, через четыре дня in vitro, этот фильм показывает миграцию клеток Шван на границе экспланта SCG.

Комбинация светлого поля и флуоресценции позволяет визуализировать S-100 GFP-положительные лебединые клетки и аксоны. Наконец, в этом фильме показана миграция шванских клеток на границе верхнего шейного ганглия ex explan. Здесь показан только флуоресцентный канал, облегчающий интерпретацию S-100 GFP-положительных клеток Швана.

После этой процедуры может быть проведен дополнительный количественный анализ, такой как количественная оценка пролиферации одной клетки или количественная оценка апоптоза одной клетки. Конечно, для анализа конечной точки необходимо провести адекватную иммуногистохимическую обработку или использовать конкретные трансгенные животные для демонстрации эффектов в живом контексте.