Изометрические и эксцентричный оценке формирования сил скелетных мышц, изолированных от мышиной модели мышечной дистрофии

Общая цель этой процедуры заключается в измерении механических свойств скелетных мышц, выделенных от мышей. Это достигается путем предварительного рассечения мышцы-разгибателя пальца или мышцы EDL, а также мышцы диафрагмы животного. После приготовления полоски диафрагмы закрепите ЭДЛ и полоску диафрагмы в чашке с насыщенным кислородом раствором Рингера, а затем привяжите шовные петли к обоим концам мышц.

Затем EDL или диафрагменная полоска закрепляется в органной ванне между двумя электродами, прикрепленными к преобразователю силы или рычагу на одном конце, и регулируется до оптимальной длины в зависимости от силы подергивания. Заключительным этапом является стимуляция мышцы с помощью ряда механических протоколов и измерение выработки силы. В конечном счете, расчет выработки силы, сопротивления повреждениям, соотношения частот сил и других свойств используется для демонстрации силы и целостности и других свойств мышцы, а также, если применимо, эффектов лечения или генетической модификации.

Этот метод может быть использован для тестирования потенциальных методов лечения мышечной дистрофии, потому что большинство этих методов лечения направлены на восстановление мышечной силы и снижение мышечной хрупкости. Хотя мы не первые, кто использует этот метод, мы регулярно используем его для изучения ряда различных моделей мышей и оценки их мышечной функции, а также для характеристики и оценки нескольких методов лечения мышечных дистрофий. Помимо доктора Кэтрин Морвуд, мы продемонстрируем эту процедуру с участием двух членов нашего физиологического центра оценки: доктора Мин Лю, научного сотрудника, и мистера Яна, специалиста по исследованиям.

Мышей, используемых в этой процедуре, обезболивают кетамином и ксилазином, чтобы они не испытывали боли или дистресса, но мышцы остаются хорошо насыщенными кислородом за счет кровообращения. Убедившись щипком пальца ноги, что животное достаточно обезболито, обездвижьте его высокие конечности с помощью медицинской ленты и снимите кожу нижней передней задней конечности, чтобы обнажить мышцы этой области, поддерживайте мышцы во влажном состоянии с помощью применения PBS через равные промежутки времени. Под рассекающим эндоскопом сделайте небольшой разрез латерально к колену, чтобы обнажить проксимальное сухожилие длинного разгибателя пальца или мышцы EDL.

В этой области есть два сухожилия, и оба должны быть перерезаны, чтобы можно было удалить EDL в медиальной лодыжке. Разрежьте сухожилие передней большеберцовой мышцы или мышцы ТА, чтобы обнажить дистальные сухожилия EDL, которые проходят вдоль плюсневых костей. Уберите мышцу ТА в сторону.

Будьте осторожны, чтобы не порезать и не прикоснуться к EDL под ним. Вернитесь к дистальным отделам сухожилий EDL и отрежьте каждое из них. Затем возьмитесь за сухожилия и осторожно оттяните EDL от остальной части конечности.

Он должен свободно освобождаться от проксимального конца. Удалите мышцу EDL и поместите в препарирующую чашку, наполненную охлажденными кислородными отжимами. Проведите мышцу через сухожилия примерно на длину покоя, которая является длиной, найденной in vivo.

Длина слишком мала, когда мышца находится в тарелке, и слишком длинна, если мышца тянет за рассекающие штифты. Завяжите швы к сухожилиям как можно ближе к мышце, но не касаясь мышцы. Зафиксируйте мышцу примерно на длине покоя с помощью швов.

Для начала этой процедуры. Сделайте надрез на коже усыпленного животного. Обнажить брюшную и грудную полость.

Откройте брюшную полость и разрежьте стенку тела чуть ниже ребер с помощью ножниц для костей, начиная с места введения диафрагмы. Разрежьте вокруг всей грудной клетки по линии ребер и прорежьте позвоночник. Разрежьте кровеносные сосуды, проходящие через центр диафрагмы, чтобы диафрагму можно было легко удалить.

Снимите диафрагму с мыши и поместите в препарирующую посуду, наполненную кислородными кольцами. Аккуратно взбалтывайте диафрагму в посуде, чтобы смыть кровь. При необходимости обновите решение для звонка.

Далее отрежьте небольшую полоску диафрагмы от центрального сухожилия к ребрам по ориентации волокон в центральной части боковых полудиафрагм. Ширина полосы должна составлять от двух до четырех миллиметров. Завяжите швы к центральному сухожилию, привяжите швы к каждому из выступающих с боков реберных концов, а затем свяжите их вместе, чтобы получилась большая петля с помощью ножниц для кости.

Обрежьте ребро по обе стороны от полосы, оставив примерно один-два миллиметра, выступ ребра по обе стороны от диафрагмы. Оценка создания силы полоски для изолированных скелетных мышц выполняется с помощью мышечной тестовой системы in vitro, чтобы закрепить мышцы в ванне механика, захватить швы и использовать их для прикрепления мышцы к жесткой стойке с одного конца и к преобразователю силы на другом конце. Хорошим приближением является длина мышц покоя.

Как было показано ранее, ванна заполняется кислородосодержащим раствором кольцев, поддерживаемым при температуре 22 градуса Цельсия. Для продления мышечной стабильности для тестирования мышцы должны отдохнуть в течение пяти минут в этой ванне перед функциональным тестированием, чтобы температура мышц была приравнена к 22 градусам Цельсия для создания сверхмаксимальных условий стимуляции. После того, как мышца помещена в ванну, используйте одиночные импульсы стимуляции продолжительностью 0,5 миллисекунды для создания подергивания и контроля выходной силы.

Постепенно увеличивайте ток до тех пор, пока сила не достигнет максимального, но устойчивого уровня, увеличивайте ток до 10% больше этого уровня, чтобы в остальных экспериментах установить оптимальную длину, во-первых, убедитесь, что мышца не слаба, но и не обучена. Хорошим приближением является длина мышц в состоянии покоя, как показано ранее. С помощью изометрических подергивающих стимуляций длина мышцы регулируется постепенно до тех пор, пока не будет получена максимальная сила.

Дайте мышце отдых около 10 секунд между каждым сокращением. Оптимальная длина мышц достигается при максимальной силе подергивания при рекордной длине мышц с помощью штангенциркуля. Для EDL это длина между миосухожильными соединениями.

Для диафрагмы это длина между центральным сухожильным соединением и прикреплением мышцы к ребру. Для определения максимальной изометрической титанической силы стимулируйте набор мышц при оптимальной длине мышцы в течение 500 миллисекунд с серией импульсов по 0,5 миллисекунды при сверхмаксимальной стимуляции и с частотой слияния. Плато для мышц EDL обычно достигается при частоте 120 Гц, а для мышц диафрагмы с частотой 100 Гц стимулируйте три раза с соответствующей частотой с периодами отдыха по пять минут между приступами стимуляции для каждой мышцы после пятиминутного отдыха.

После выполнения изометрических сокращений приступайте к процедуре эксцентрических сокращений. Стимулируйте мышцы с частотой 80 Гц изометрически в течение первых 500 миллисекунд, а затем растягивайте мышцы на 10% оптимальной длины мышц в течение последних 200 миллисекунд. Повторите схему стимуляции с пятиминутными перерывами между ними.

Для желаемого количества эксцентрических сокращений измерьте силу каждого сжатия в период времени до растяжения. Рассчитайте падение силы между первым и последним сокращением по завершении функционального испытания. Укоротите длину мышцы и аккуратно снимите мышцу с датчика и поста.

Верните мышцу в препарирующую посуду с колокольчиками. Снимите швы с мышц для мышцы EDL. Дважды заблокируйте мышцу, а затем взвесьте ее перед последующей обработкой.

Это будет важно для расчета площади поперечного сечения и удельной силы для мышцы диафрагмы в 0,1% про и оранжевого цвета, мембраны и перфорированного красителя в течение 15-20 минут. Это обеспечит индекс диссекционного повреждения, рассечет мышцу диафрагмы в стороне от костного вставки, а также центральное сухожилие. Это необходимо для обеспечения точного взвешивания мышечной кляксы перед взвешиванием и последующей подготовкой.

Площадь поперечного сечения или CSA рассчитывается по следующей формуле, где L над LO - отношение волокон к длине мышц, а 1,06 - ожидаемые значения плотности мышц для изометрических сил в диком типе C 57 и мышечной дистрофии или мышцах M-D-X-E-D-L у 12-недельных животных. Поскольку мышцы MDX демонстрируют компенсаторную гипертрофию, общая сумма до титанической силы может быть выше в мышцах MDX по сравнению с контрольной группой соответствующего возраста. Более подходящей мерой функционального выхода является удельная сила, где сила нормализуется для площади поперечного сечения.

Чтобы рассчитать эту величину, удельная сила зависит от внутренней функциональной способности мышцы, где слабость дистрофических мышц более очевидна, когда учитываются как абсолютная сила, так и площадь поперечного сечения. В этом исследовании было замечено, что мышцы EDL мышей MDX генерируют примерно на 20-25% меньше удельных сил, чем у мышей дикого типа в возрасте от 10 до 26 недель. Для диафрагмы для сравнения важна только удельная сила, потому что препарат представляет собой часть мышцы, зависящую от рассечения.

Сравнение удельной силы между мышцей дикого типа C 57, обозначенной синей линией, и мышцей диафрагмы MDX, обозначенной красными столбцами, отражает прогрессирующую патологию в этой ткани. Изометрическое усилие уменьшается с возрастом, так что к шестимесячному возрасту мышцы диафрагмы мышей MDX производят не более половины функционального результата полосок диафрагмы из контрольных групп соответствующего по возрасту дикого типа. Пример эксцентрических сокращений при испытании диафрагмы показан на этом рисунке.

С каждым последующим эксцентриковым сокращением выходная сила уменьшается на полосках диафрагмы как у дикого типа C 57, показанного синим, так и у мышей MDX, показанных красным. Тем не менее, потеря силы более драматична в образцах мышц мыши MDX, предположительно из-за отсутствия дистрофина и связанных с ним белков после освоения. Эта техника может быть выполнена примерно за один час для одной мышцы, если она выполняется правильно в соответствии с этой техникой.

Другие методы, такие как вестерн-блоттинг или другие биохимические измерения, могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы, такие как изменение уровня белка или нормализация мышечной целостности. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как препарировать ЭДЛ и диафрагму от мыши, а также как измерять и анализировать выработку силы до и после эксцентрических сокращений.