Всего горы РНК Флуоресцентные На месте Гибридизация Drosophila Эмбрионы

Эта процедура описывает оптимизированный метод рыб для оценки экспрессии и особенностей локализации РНК в целых эмбрионах дрозофилы. Это достигается путем предварительного синтеза меченого РНК-зонда, комплементарного к Mr NA или представляющей интерес РНК без покрытия, путем транскрипции in vitro надлежащим образом выбранной матрицы ДНК. Параллельно с этим клетки для популяции мух используются для сбора, фиксации и перме эмбрионов желаемой стадии развития.

После нескольких этапов постфиксации эмбрионы гибридизуются с помощью меченого зонда антисмысловой РНК. Наконец, после обширной промывки образцов гибридизованный зонд детектируют путем иммуномечения специфическим антителом и реагентами для детектирования флюорохрома, конъюгированными с флюорохром, что обеспечивает чувствительное считывание распределения целевой РНК. В конечном счете, результаты дают флуоресцентные сигналы с высоким разрешением, которые анализируются с помощью стандартной флуоресцентной микроскопии для документирования пространственных и временных особенностей экспрессии целевой РНК во время эмбриогенеза дрозофилы.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как Норн-блот или R-T-P-C-R заключается в том, что можно оценить экспрессию РНК в интактном образце ткани. Хотя этот метод предназначен для анализа свойств экспрессии РНК у ранних эмбрионов дрозофилы, он также может быть использован для анализа эмбрионов на более поздних стадиях развития тканей, рассеченных личинками или взрослыми мухами. Важным аспектом нашей процедуры является увеличение количества образцов, которое мы можем достичь, выполняя рыбу в месте ПЦР, что значительно увеличивает пропускную способность подхода.

В число членов лаборатории, демонстрирующих эту процедуру, входят студенты бакалавриата, сопротивляющиеся исследованиям, аспиранты и постдокторанты. Начните с хорошо откормленных клеток для популяции. Замените тарелку на дрожжевую пластину с яблочным соком и оставьте мух на час при температуре 25 градусов по Цельсию.

Затем замените дрожжевую пластину с яблочным соком, чтобы собрать эмбрионы на ранней стадии. Инкубируйте клетку при температуре 25 градусов Цельсия и подождите, пока не будет достигнута желаемая стадия развития эмбрионов, ожидая в химическом колпаке, смешайте химикаты до получения 37% формальдегида в стеклянном флаконе для ингаляций. Кипятят раствор до полного растворения порошка ПФА.

Затем остудите его до комнатной температуры и отфильтруйте в новый сцинтилляционный флакон. Далее приготовьте раствор для двухфазной фиксации. Соедините PBS с 37% формальдегидом в сцинтилляционном флаконе, а затем добавьте гептан, когда будете готовы.

Соберите эмбрионы с тарелки с яблочным соком комнатной температуры, водой из-под крана и аккуратно подметайте тонкой кистью. Переложите ресуспензионные эмбрионы в корзину и промойте их теплой водой из-под крана. Теперь окуните эмбрионы в 90 секунд, окунув корзину в свежий 3% раствор отбеливателя.

Затем удалите отбеливатель теплой водой из-под крана, пока запах отбеливателя не исчезнет. Чтобы собрать эмбрионы, разберите корзину для сбора и аккуратно перенесите эмбрионы в раствор для двухфазной фиксации. С помощью кисти эмбрионы будут накапливаться на границе между слоями PBS и гептаном.

Теперь закупорьте сцинтилляционные флаконы, закрепите их на вихревом миксере и встряхивайте в течение 20 минут на самом низком уровне. После встряхивания отбросьте большую часть нижних PBS и верхних фаз кишечника с помощью пастбищной пипетки. Затем отсасывайте оставшуюся смесь в пипетку и аккуратно отсаживайте нижнюю фазу, не теряя эмбрионов.

Поместите эмбрионы в пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую двухфазный раствор из 500 микролитров гептана и 500 микролитров метанола. Энергично встряхивайте трубку в течение 30-45 секунд, чтобы мембраны надколенника треснули. После растрескивания эмбрионы погружаются в метанол.

Отбракуйте верхнюю фазу и нерастрескавшиеся эмбрионы и добавьте один миллилитр метанола. Теперь коротко встряхните пробирку в течение пяти секунд и трижды промойте зародыши метанолом. После промывок эмбрионы могут храниться в течение нескольких месяцев при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

Начните с добавления 500 микролитров PK к каждому из эмбрионов и инкубируйте образцы в течение 10 минут при комнатной температуре, не встряхивая. Будьте очень осторожны, чтобы не повредить образцы, переваривая их белком или небрежно манипулируя. Во время инкубации ПК перемешивайте эмбрионы каждые две минуты, продувая их пипеткой.

Через 10 минут положите эмбрионы на лед на час. Через час удалите раствор ПК при комнатной температуре. Промойте эмбрионы дважды глицином в PBT в течение двух минут.

Теперь зафиксируйте образцы на 20 минут в одном миллилитре 3,7% формальдегида в ПБТ с покачиванием. Смойте формальдегид пятью полосканиями в ПБТ. Затем промойте эмбрионы одним миллилитром равных объемов раствором ПБТ и HI, и замените смесь от 0,5 до одного миллилитра чистого раствора.

На этом этапе эмбрионы могут храниться от нескольких дней до недель при температуре минус 20 градусов по Цельсию. В 96 луночный планшет аликвотируется от 10 до 15 микролитров поселившихся эмбрионов на лунку. Используйте наконечник с широким отверстием, чтобы не повредить эмбрионы.

Теперь приготовьте раствор для предварительной гибридизации, вскипятив 100 микролитров раствора хайпа на образец. Ну и в течение пяти минут остудите раствор Pre-Hype на льду в течение пяти минут, а затем добавьте по 100 микролитров его в каждую лунку, в которой находятся образцы эмбрионов. Извлеките подготовленный зонд РНК, количественно измеренный с помощью спектрофотометра NanoDrop.

Кроме того, чтобы убедиться в качестве щупа, нанесите его на агрогель на один-два микролитра. Теперь для каждого образца разведите около 100 нанограмм зонда в 100 микролитрах раствора HI. Очень важно работать в условиях, свободных от РНК.

При обращении с зондом. Нагрейте раствор до 80 градусов Цельсия в течение трех минут. Затем остудите его на льду не менее пяти минут.

Его можно держать охлажденным в течение нескольких часов. Извлеките планшет и удалите раствор Pre-Hype из эмбрионов с помощью аспирации. Затем добавьте в каждую по 100 микролитров раствора хайпа с РНК-зондом.

Хорошо гибридизируйте зонд при температуре 56 градусов Цельсия в течение 12-16 часов на следующий день. Серия из пяти растворов предварительно прогревается при температуре 56 градусов Цельсия. Первый – это чисто хайповое решение, а последний – чистый PBT.

Остальные три являются разбавлением HI в PBT. После быстрого нагревания промойте образцы один раз в чистом растворе для хайпа. Затем выполните три 15-минутных промывки, начиная с наименее разбавленного раствора для хайпа, за которым следует каждое из последующих разбавлений.

Наконец, промойте образцы четыре раза в течение пяти минут в чистом PBT. Затем доведите образцы до комнатной температуры. Теперь перейдем к применению антител для обнаружения зонда, чтобы улучшить смешивание образцов.

Во время этих этапов планшет может быть помещен в небольшую коробку, которая может быть прикреплена к мутирующему смесителю с использованием описанного протокола, классическое правило пары ген ранта был проанализирован на различных этапах эмбриогенеза. Анализ рыб показал, как первоначальная широкая экспрессия в средней части эмбриона на эмбриональной четвертой стадии преобразуется в сегментированный полосатый рисунок. На более поздних стадиях исследования рыбы проводились с использованием различных дигген и меченых антисмысловых РНК-зондов, гибридизированных с эмбрионами дрозофилы возрастом от нуля до четырех часов.

Гибридизованные зонды были обнаружены путем последовательной инкубации с биотинилированным антигеном и антителами strep avid в HRP и церамиде. Образцы были смонтированы и проанализированы с помощью флуоресцентной микроскопии. При попытке использовать эту процедуру важно использовать меры предосторожности на различных этапах, таких как защита зондов РНК и деградации, работа в условиях, свободных от РНК, и использование запасов, свободных от РНК.

После того, как эта основа будет освоена, к методу могут быть добавлены дополнительные шаги для выполнения опыта множественного мечения с целью визуализации различных РНК или специфических белковых маркеров в одном и том же образце. После просмотра этого видео у вас будет хорошее представление о том, как провести флуоресцентную гибридизацию в C-2, чтобы задокументировать экспрессию или динамику субклеточной локализации вашей любимой РНК во время эмбриогенеза дрозофилы Happy Fishing.