Золотистый стафилококк рост использования человеческого гемоглобина в качестве источника железа

В этом эксперименте проверяется способность золотистого стафилококка использовать человеческий гемоглобин в качестве единственного источника железа. Во-первых, выделите эритроциты из свежей человеческой крови. Очистите гемоглобин с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, чтобы обеспечить целостность гемоглобина.

Теперь добавьте гемоглобин в истощенную железом среду для подачи железа в виде гемоглобина следующей культуры. S reus. В присутствии гемоглобина и измерить его способность использовать гемоглобин в качестве источника железа.

Результаты показывают, что AS reus размножается в присутствии гемоглобина в качестве единственного источника железа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии, например, может ли патоген использовать белки хозяина в качестве источников железа и какие механизмы необходимы для использования железа с помощью этого процесса. Таким образом, этот метод может дать представление о приобретении железа стафилококком из гемоглобина.

Он также может быть применен для изучения других бактерий и того, как они используют железосодержащие белки хозяина. Демонстрировать эту технику будут GLA Ani и Кэтрин Хейли из моей лаборатории. Сначала получить свежевыделенную человеческую кровь, дополненную антикоагулянтом и поддерживать при температуре четыре градуса Цельсия на протяжении всей очистки Гранулы эритроцитов путем центрифугирования в течение 20 минут при 15 000 G. Осторожно аспирировать и аккуратно ресуспендировать гранулу в ледяном 0,9% растворе хлорида натрия После трех стирок восстановить, суспензировать гранулу в одном объеме ледяного 10 миллимолярного трисса, HCL к эритроцитам за счет осмотического давления.

Затем добавьте толуол до 20% конечного объема и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия на ротаторе в течение ночи. Далее центрифуга. Лизат при концентрации 20 000 G в час.

Соберите среднюю фракцию гемолизата, оставив верхний слой толуола и гранулу нетронутыми. Пропустите гемолизат через шприцевой фильтр 0,44 мкм. Если раствор содержит твердые частицы и не может быть пропущен через фильтр, повторите высокоскоростное центрифугирование.

Теперь очистите гемоглобин с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии анионообменной колонки. Используйте подвижную фазу A с 10 миллимолярным трисом, HCL, и подвижную фазу B с 10 ммиланярным трисом, HCL плюс 0,5 молярного натрия хлорида. Запустите градиент растворителя B от 0% до 100% в течение двух минут со скоростью потока два миллилитра в минуту.

Контролируйте элюирование на основе поглощения на 410 нанометрах и 280 нанометрах. Соберите фракцию, характеризующуюся ярко-красным цветом и заметным пиком поглощения. Диализируйте элюирование против фосфатно-солевого буфера в течение примерно 16 часов.

Чтобы стерилизовать образец, пропустите его через шприц-фильтр 0,22 микрометра для определения концентрации гемоглобина. Подготовьте стандартные решения HP в PBS. Теперь смешайте стандартные растворы или образцы растворов с двумя реагентами xra kins в соотношении один к одному в 96 луночных планшетах после 15-минутной инкубации измерьте поглощение на 540 нанометрах.

Постройте стандартную кривую и определите концентрацию HP в образцах от пяти до 15 миллиграммов на миллилитр. Выход представляет собой типичный прогон аликвот от 15 до 20 мкг очищенного гемоглобина образца на двух страницах с 15% STS гелем. Окрасьте один из гелей и перенесите белки из другого геля на нитроцеллюлозную мембрану в иммуноблоттинг для замораживания гемоглобина и храните один миллилитр выделенного гемоглобина в жидком азоте из замороженного бульонного пучка S aureus на триптихе, соевом агаре, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20-24 часов.

Инокулируйте отдельные колонии в пять миллилитров RPMI, содержащих E-D-D-H-A, и культивируйте при 37 градусах Цельсия с встряхиванием при 180 RP M в течение ночи. Гранулируйте бактерии центрифугированием в течение пяти минут при давлении 7 500 G. Затем Resus, суспендируйте бактерии в RPMI, содержащем 0,5 миллимоляра E-D-D-H-A, и нормализуйте до наружного диаметра 600, равного примерно трем. Затем приготовьте N-R-P-M-I, содержащий 2,5 мкг на миллилитр, HB и от 0,1 до одного миллимоляра E-D-D-H-A для хелатирования свободного железа.

Теперь субкультурируя 10 микролитров бактериальной суспензии в один миллилитр N-R-P-M-I плюс E-D-D-H-A плюс HP, инкубируйте культуры при 37 градусах Цельсия в течение 48 часов с встряхиванием при 180 RRP M каждые шесть-12 часов. Удалите 50 микролитров питательной смеси со 150 микролитрами PBS в 96 луночных планшетах и снимите показания наружного диаметра 600. При такой ВЭЖХ-очистке человеческого гемоглобина от гемолизата измеряется поглощение элюата на длинах волн 280 и 410 нанометров с пятой фракцией, содержащей гемоглобин.

Как правило, на один препарат получается от пяти до 15 миллиграммов гемоглобина на миллилитр. Очищенный гемоглобин анализировали с помощью SDS в двух экземплярах, и гели либо обозначали белки, либо переносили на нитроцеллюлозу и подвергали иммуноблотированию. Затем очищенный человеческий гемоглобин был протестирован на способность поддерживать рост ASUS дикого типа и ASUS, в котором отсутствует рецептор гемоглобина, необходимый для получения железа, полученного из гемоглобина.

Увеличение оптической плотности культур с течением времени указывает на то, что в N-R-P-M-I плюс E-D-D-H-A плюс hb дикий тип ASUS размножается, а мутантный — нет. В отличие от этого, способность использовать добавленное свободное железо идентична как у дикого типа, так и у мутантных штаммов, ни один из них не размножается в отсутствие источника. В этом сравнении сред с добавлением гемоглобина, очищенного из свежей крови, или лиофилизированного гемоглобина, гемоглобин, очищенный из крови, требует ISDB для роста.

В то время как лиофилизированный гемоглобин способствует размножению мутанта ISDB После освоения, надлежащее очищение гемоглобина может быть завершено за несколько часов. Помните, что доноры являются потенциальными носителями патогенов, передающихся через кровь, поэтому относитесь к человеческой крови как к биологически опасному материалу.