Комбинированные иммунофлуоресценции и ДНК рыб на 3D-сохранена интерфазных ядер для изучения изменений в 3D-ядерный организации

Общая цель этой процедуры заключается в одновременном обнаружении модификаций хроматина и последовательностей ДНК с помощью 3D-конфокальной микроскопии: сначала генерируются специфические зонды ДНК. Между тем, экспериментальные клетки фиксируются пермой и иммуноокрашиваются. Для интересующих гистоновых маркеров.

Затем клетки денатурируются и в течение ночи флуоресцентируются внутри вас. Гибридизация или гибридизация рыб проводится с помощью одного или нескольких зондов ДНК. Наконец, ячейки промываются и монтируются для 3D-флуоресценции.

Микроскопический анализ полученных изображений выявляет ядерную локализацию интересующих локусов и ассоциацию со специфическими модификациями камня Гиса. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она сочетает в себе визуализацию ядерного белка, в том числе камней с геномными локусами в ядрах 3D-резерва, и может помочь ответить на ключевые вопросы в области эпигенетической ядерной организации хроматина или регуляции генов. Для этой процедуры для маркировки могут использоваться либо бэк-плазмиды, либо продукты ПЦР.

Они должны быть подготовлены в соответствии с описанием в сопроводительном тексте. Учтите, что для надежного сигнала рыбы щупы должны расходовать не менее 10 килобазовой пары. Начните эту процедуру с объединения одного микрограмма ДНК и 0,17 микрограмма РНК А в микроцентрифужной пробирке.

Инкубировать в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации кратковременно инактивируйте РНК А на льду и добавьте соответствующее количество трансляции Ника. Перемешивайте, выдерживайте в течение двух часов при температуре 16 градусов Цельсия на водяной бане или в холодном блоке для инактивации реакции.

Поместите пробирки при температуре минус 80 градусов Цельсия на один час или минус 20 градусов Цельсия на ночь. Далее определите размер щупа на геле 2%agros. Мазок должен быть в пределах 101 000 пар оснований, причем большинство должно составлять примерно от 300 до 500 пар оснований.

Обратите внимание, что мазок научно-фантастических зондов не виден. После того, как размер будет определен, очистите зонды диализом на 0,02. Пятимиллиметровые фильтры в двухлитровых стаканах наполнены водой.

200 микрограммов зонда на центр каждого плавающего фильтра, затем инкубируйте в течение двух часов в темноте. После инкубации с помощью пипетки аккуратно перенесите зонд из фильтров в свежую микроцентрифужную пробирку. Далее добавьте к щупам факторы блокировки следующим образом.

Один микрограмм CO 1D NA. Один микрограмм высокоблокирующей ДНК и 10 микрограмм спермы лосося на один микрограмм ДНК-зонда и смесь хранят ДНК-зонды при температуре минус 20 градусов Цельсия. В день процедуры с рыбой щупы отсаживают и подготавливают к использованию. Обратите внимание, что действия, описанные в этом разделе видео, должны выполняться параллельно с шагами, описанными в следующем разделе.

Чтобы осадить зонды, следуйте за ними и объедините их с 0,1 объема трехмолярного ацетата натрия при pH 5,2 и 2,5 объема 100% этанола инкубируйте в течение одного часа при температуре минус 80 градусов Цельсия. После инкубации вращайте зонды при температуре 16 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. После отжима выбросьте надосадочную жидкость и высушите гранулы на воздухе в темноте.

В зависимости от количества и цвета щупов гранула может быть видна или не быть видна. Резус суспендирует гранулу в 15 микролитрах буфера для гибридизации в зависимости от условий испытания и встряхивает с помощью термомиксера einor в темноте при температуре от 37 до 45 градусов Цельсия в течение примерно 20 минут. Затем, чтобы денатурировать, зонды инкубируют их в течение пяти минут при температуре от 75 до 95 градусов Цельсия.

Затем для подготовки зондов инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30-60 минут на термомиксере. Сразу после инкубации зонды будут прикладываться к клеткам на покровных листах, как описано в следующем разделе видео. Обратите внимание, что на следующих этапах время инкубации должно быть изменено в соответствии с потребностями используемых антител и клеток.

Действия, описанные в этом разделе видео, должны выполняться параллельно с действиями в предыдущем разделе, как описано в сопроводительном тексте. Капните неадгезивные клетки поверх покрытых полилизином покровных колпачков в лунки из шести луночных планшетов и дайте им прикрепиться в течение пяти минут. Затем аккуратно добавьте два миллилитра 2%-ного параформного альдегида в PBS, инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре после инкубации.

Промойте каждую лунку PB S3 раза, затем, чтобы проникнуть в клетки, добавьте два миллилитра ледяного льда, 0,4% Triton X 100 в PBS и инкубируйте в течение пяти минут на льду. После аспирации проницаемого раствора, если ДНК рыб будет сочетаться с иммунофлюоресценцией, действуйте следующим образом. Сначала пипеткой нанесите 100 микролитров блокирующего раствора на парам во увлажненной камере.

Поместите защитную ячейку лицевой стороной вниз на раствор для блокировки и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. Далее пересадка. На крышку соскальзывают до 100 микролитров капель первичного антитела, разведенного в блокирующем растворе.

В этом случае используемое антитело распознает фосфорилированный сирийский 1 39 из H two A x или gamma H two A x. Инкубируйте предметные стекла во увлажненной камере в течение одного часа при комнатной температуре. После инкубации с помощью щипцов аккуратно удалите покровные листы.

Если чехлы покрытия трудно поднять, затопите PBS и повторите попытку. Переложите каждый предметный стек в лунку из шестерки. Лунку планшета, содержащего два миллилитра 0,2%БСА 0,1%твин 20, в PBS промыть крышку скользящего в этом растворе три раза в течение пяти минут при комнатной температуре с встряхиванием, затем инкубировать клетки с соответствующим флуорофором конъюгированным вторичным антителом, разведенным в блокирующем растворе в течение одного часа при комнатной температуре в темной и влажной камере на параме.

Как и перед инкубацией, промыть клетки в 0,1%-20 в PB S3 раза в течение пяти минут при комнатной температуре в темноте для постфиксации клеток, погрузить их в два миллилитра 2%-ного параформальдегида в PBS на 10 минут при комнатной температуре в темноте. После того, как клетки были окрашены или если они не окрашены, продолжайте исследовать ДНК рыб, промыв покровные листы три раза в PBS. Затем поместите крышку клеточной стороной вниз на каплю 100 микролитров 0,1 миллиграмма на миллилитр.

РНК на параме в увлажненной камере и инкубируют в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации промойте крышку стекла три раза в PBS, затем проколите клетки в ледяной 0,7%Trix 100 в 0,1 молярной соляной кислоте в течение 10 минут на льду в темноте. После трех промываний в PBS денатурируют клетки в 1,9 молярной соляной кислоте в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте и еще трижды промывают в ледяном PBS рядом с гибридизацией клеток с зондами.

Поместите защитный стебль ячейки вниз на каплю зонда объемом 15 микролитров, приготовленную в предыдущем разделе этого видео, на предметное стекло микроскопа, запечатайте предметное стекло резиновым цементом и выдерживайте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в темной увлажненной камере. На следующий день с помощью щипцов осторожно удалите резиновый цемент со стекол. Затем процедите покровные листы с помощью двух актов SSC и с помощью щипцов аккуратно удалите покровные листы с ячейками.

Затем поместите их в лунки, содержащие моющий раствор. Далее выполните следующие промывки с встряхиванием в темноте двух XSSC в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия, двух XSSC в течение 30 минут при комнатной температуре и одного XSSC в течение 30 минут при комнатной температуре для крепления слайдов, поместите защитные стекла ячейкой вниз на каплю от 10 до 15 микролитров пролонгированного золотого монтажного носителя, содержащего 1,5 миллиграмма на миллилитр DPI уплотнения с лаком для ногтей. Предметные стекла могут храниться в течение нескольких месяцев при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

После того, как слайды будут готовы, соберите 3D-изображения с оптическими срезами, разделенными на 0,3 микрона, и проанализируйте, как описано в сопроводительном документе, чтобы определить, связаны ли изменения в ассоциации двух аллелей локусов антигенных рецепторов с регуляцией процесса рекомбинации VDJ во время развития лимфоцитов, дикого типа и мутантных клеток с дефицитом белка рекомбиназы Rag One были использованы для изучения интересующего локуса с использованием ДНК. Рыбий зонд был получен из задней части, которая охватывает примерно 200 килопар оснований, охватывающих область генома. Расстояния между аллелями измеряли между центрами масс каждого обратного сигнала в стеках 3D-изображений, пунктирными кругами, очерчивали формы ядер. Показанные масштабные линейки представляют собой кумулятивные кривые распределения частот в один микрон, которые затем были сгенерированы, чтобы показать весь диапазон расстояний между двумя аллелями, измеренными в клетках дикого типа и мутантных клетках.

Затем был использован непараметрический двухвыборочный тест KS для оценки значимости различий между двумя распределениями. Диапазон наиболее устойчивых различий в межаллельных расстояниях был оценен с помощью серии из двух точных тестов Tail Fisher, обозначенных синими точками. Наиболее надежные значения P, обозначенные более высокими точками, были обнаружены для расстояний около одного микрона.

Таким образом, порог для тесной ассоциации или спаривания двух аллелей был установлен на уровне одного микрона. Показанные здесь кумулятивные частотные кривые показывают диапазон расстояний для тесной связи двух аллелей от нуля до 1,5 микрон в двух различных биологических условиях. Значимость спаривания двух аллелей оценивали с помощью точного теста Фишера с двумя хвостами для отсечения в один микрон.

Этот график показывает, что в мутантном состоянии два аллеля не связаны с высокой частотой, как в диком типе. Таким образом, недостающий белок rag one участвует в иническом спаривании. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как совместить иммунофлюоресценцию и ДНК рыб.

Этот метод проложил путь для исследователей, дав представление о глобальных изменениях в ядерной архитектуре, поведении конкретных геномных локусов и областей в ядерном пространстве, а также о связи конкретных ядерных белков в этих областях. И это помогает понять механизмы, лежащие в основе различных заболеваний после этой процедуры. Другие методы, такие как методы пропускания льда по всему геному, такие как хроматин, иммуноосаждение или поиск чипов или подтверждение захвата хромосомы, в сочетании с глубоким секвенированием, таким как fore five C или IC, могут быть выполнены для получения глобальных данных о клеточных популяциях.