Жить изображений на наркотики Ответы на микроокружение опухоли в мышиных моделях рака молочной железы

Общая цель этой процедуры заключается в отслеживании в режиме реального времени проникновения лекарственного средства и терапевтического ответа на введение терапевтического препарата. Это достигается путем предварительной обработки животного препаратом. Затем паховая молочная железа, содержащая опухоль, обнажается путем создания кожного лоскута.

Затем мышь переводят на микроскопическую стадию, измеряют насыщение крови кислородом и частоту пульса, а также вставляют внутреннюю капельницу для введения жидкости и лекарств или красителей. Наконец, покадровые изображения собираются для последующего анализа. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают изменения в гибели клеток или взаимодействии стромы опухоли в ответ на лекарственный препарат с помощью конфокальной микроскопии опухолей молочной железы мышей с помощью живого вращающегося диска.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микроокружения опухоли, например, как различные компоненты стромы опухоли влияют на ответ на терапию. Прежде чем начать, ознакомьтесь с письменным протоколом, чтобы ознакомиться с типичными графиками введения лекарств и визуализации. Включите стерилизатор горячих шариков и дайте ему нагреться не менее чем до 200 градусов по Цельсию.

После мытья хирургических инструментов в воде с мылом, включая пару щипцов с зубами, пару зубчатых щипцов и две пары ножниц, используйте стерилизатор для горячих шариков, чтобы стерилизовать их в течение не менее 30 секунд. Тогда пусть они это делают. Классно. Поместите лабораторную ванночку на крышку из пенополистирола, которая будет использоваться в качестве хирургической платформы.

Используйте лабораторную ленту, чтобы прикрепить носовой конус с линией к анестезиологической системе к лабораторному замачивателю и определенную иглу 18 калибра на полтора дюйма через ленту в крышку из пенополистирола с обеих сторон носового конуса, чтобы закрепить носовой конус на месте. Отложите в сторону стерильную марлю Бетадин. Две 70%-ные изопропаноловые протирки, предметное стекло микроскопа, суперклей и четыре куска лабораторной ленты шириной в полдюйма.

После обезболивания животное в индукционной камере, когда оно глубоко дышит и медленно перекладывает мышь на операционную платформу вентральной стороной вверх. Чтобы избежать высокого давления, откройте анестезиологическую линию к операционной платформе, а затем закройте анестезиологическую линию до индукционной камеры. Уменьшите концентрацию изофлурана с 4% до 2,5%Убедитесь, что глубина анестезии достаточна для хирургического вмешательства, выполнив щиплет подушечки стопы.

Если животное не реагирует, используйте четыре куска лабораторной ленты, чтобы закрепить его конечности на операционной платформе, и используйте электрическую бритву, чтобы удалить шерсть с вентральной поверхности. Используйте салфетки с 70% изопропанолом с последующим нанесением бетадина на стерильную марлю для дезинфекции брюшной поверхности животного с помощью ножниц и щипцов с зубами. Сделайте подкожный вентральный разрез по средней линии примерно на три миллиметра над мочеиспускательным каналом до мечевидного отростка.

Следите за тем, чтобы не проколоть или не разрезать брюшину ножницами и зубчатыми щипцами. Аккуратно отделяет кожу от брюшной полости с паховой молочной железой, содержащей опухоль, которую необходимо визуализировать. Приложите предметное стекло микроскопа к кожному лоскуту так, чтобы основная масса опухоли сидела ровно после того, как мышь будет помещена на предметную область, и чтобы ей не мешали задние конечности.

После того, как предметное стекло микроскопа будет правильно установлено, используйте суперклей, чтобы прикрепить предметное стекло к внешней поверхности кожи. Снимите лабораторную ленту, фиксирующую конечности животного. Откройте анестезиологическую линию на предметном столике микроскопа, а затем закройте анестезиологическую линию на операционную платформу.

Быстро переведите животное на сцену для микроскопа После того, как животное будет переведено, расположите и закрепите анестезиологическую капельницу и носовой конус, чтобы мышь оставалась под наркозом и находилась в удобном положении. Уменьшите концентрацию изофлурана до 1,5%. Обнажите опухоль так, чтобы она располагалась сверху и в центре одного из стеклянных закрытых портов визуализации на предметном столике микроскопа. Введите постоянную внутрибрюшинную капельницу с помощью крылатого инфузионного набора, прикрепленного к одномиллилитровому шприцу, содержащему стерильный физиологический раствор PBS или физиологический раствор с йодидом пропидия.

Когда внутрибрюшинная капельница введена, введите животному 100 микролитров физиологического раствора с йодидом пропидида и продолжайте вводить 50 микролитров физиологического раствора с йодидом пропидида каждый час до завершения сеанса визуализации. С помощью окуляров убедитесь, что опухоль правильно расположена и аккуратно приклеена к предметному стеклу микроскопа и внутрибрюшинной линии. Предметное стекло должно быть закреплено достаточно свободно, чтобы не препятствовать притоку крови к ткани.

Заклеивание предметного стекла микроскопа помогает свести к минимуму артефакты изображения, вызванные дыханием животного, для получения покадровых изображений. Используйте программное обеспечение с открытым исходным кодом micromanager, компилируйте и анализируйте необработанные данные с помощью IRIS или другого программного обеспечения для анализа изображений. Флуоресцентно конъюгированные нити DExT могут быть использованы в качестве суррогатного маркера для доставки лекарств в ткани.

Здесь показано поступление фитзи конъюгированных двух мегадальтон декстран внутривенно, введенных мыши, экспрессирующей синий флуоресцентный белок в клетках рака молочной железы. После поступления препарата в опухоль можно визуализировать экстравазацию и диффузию для определения внутрисосудистого периода полувыведения и распределения препарата. Здесь показана экстравазация и распределение конъюгированного 10 килодальтона декстрана внутривенно, введенного мыши, экспрессирующей синий флуоресцентный белок в клетках рака молочной железы и зеленый флуоресцентный белок в миелоидных клетках.

Визуализация может предоставить информацию о типе гибели раковых клеток. Здесь структурные ядерные изменения, свидетельствующие о некрозе или апоптозе, наблюдаются у мыши, экспрессирующей зеленый флуоресцентный белок, конъюгированный с его соном two b. После лечения доксорубицином индуцированная химиотерапией гибель раковых клеток часто приводит к реактивному набору иммунных клеток в опухоли.

Вот пример стромального ответа на острое лечение доксорубицином у мыши, экспрессирующей синие и зеленые флуоресцентные белки в раке молочной железы и миелоидных клетках соответственно. В дополнение к визуализации общего стромального ответа на химиотерапию, здесь также могут быть визуализированы специализированные стромальные ответы. Показан фагоцитоз некротического клеточного материала соседней клеткой после освоения.

Этот метод может быть выполнен за 30-60 минут, а животные могут быть визуализированы в течение 12-40 часов, если он выполнен правильно.