Cryosectioning дрожжи Сообщества для экспертизы флуоресценции Patterns

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы получить поперечные срезы дрожжевых сообществ для изучения пространственного распределения различных популяций флуоресцентных клеток в сообществе. Это достигается путем предварительного замораживания сообщества, а затем его фиксации с помощью метанола для сохранения пространственного распределения клеток в сообществе. На втором этапе метанол испаряется, чтобы обеспечить проникновение в встраиваемое соединение OCT.

Затем встроенное сообщество замораживается для подготовки к криосекции. Далее проводится крио-оме разделов. Сообщество и поперечные срезы могут быть визуализированы под флуоресцентным микроскопом Получены результаты, которые показывают пространственное распределение популяций флуоресцентных клеток внутри сообщества.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как оптическое сечение, заключается в том, что он позволяет выявить пространственное распределение популяций в глубине этих сообществ. Для начала этой процедуры выращивают дрожжевые сообщества на мембранном фильтре. Этот протокол соответствует типичному сообществу менее двух умножить на 10 на восемь ячеек на мембранном фильтре диаметром шесть миллиметров, расположенном в морозильной камере с температурой минус 20 градусов по Цельсию.

Чтобы сохранить большую степень флуоресценции, используйте кусок фильтровальной бумаги watman 5 4 1, чтобы покрыть дно диаметром в один сантиметр. Ну, эта фильтровальная бумага используется в качестве носителя для переноса сообщества На более поздних этапах добавьте в колодец один миллилитр минус 20 градусов по Цельсию, 100% метанола, и оставьте колодец при температуре минус 20 градусов по Цельсию, чтобы температура выровнялась. Теперь заморозьте дрожжевое сообщество, погрузив с помощью пинцета мембранный фильтр с сообществом в жидкий азот не менее чем на 15 секунд.

Далее переложите замерзшее сообщество в колодец с температурой минус 20 градусов по Цельсию. Метанол в морозильной камере гарантирует, что сообщество будет находиться в горизонтальном положении. При погружении его в метанол подождите 20 минут, мембранный фильтр начнет распадаться в метаноле.

Через 20 минут перенесите население с помощью фильтровальной бумаги Carrier Wattman из метанолового колодца в холодную чашку Петри, где температура составляет минус 20 градусов по Цельсию. При переносе держите сообщество в курсе фильтра Watman носителя. Удалите лишние капли метанола с помощью другого листа плотной бумаги Ватмана, прежде чем положить его в холодную чашку Петри.

Это гарантирует, что время испарения метанола будет одинаковым от образца к образцу. Подождите от четырех до шести часов, пока метанол испарится. Своевременное прекращение испарения имеет решающее значение для успеха этой процедуры.

Чтобы избежать пересушивания образца, периодически проверяйте состояние дрожжевого сообщества во время выпаривания, пока метанол испаряется. Сделайте прямоугольный кубический контейнер из алюминиевой фольги, достаточно большой такой, чтобы образец имел не менее двух миллиметровых полей с каждой стороны. Добавьте каплю ОКТ на дно этого контейнера, чтобы образец был окружен ОКТ со всех сторон.

Когда испарение завершится, достаньте образец из морозильной камеры с температурой минус 20 градусов Цельсия. Отрежьте части фильтровальной бумаги, не покрытые дрожжевым сообществом. Важно выполнить этот шаг быстро.

Во избежание пересушивания образца. Поместите сообщество на нижнюю поверхность контейнера из алюминиевой фольги и немедленно накройте образец ОКТ на три-четыре миллиметра выше высоты сообщества. Подождите 10 минут.

Наконец, поместите внедренный образец ОКТ на металлическую пластину на сухой лед, чтобы заморозить замороженные сообщества при температуре минус 20 градусов Цельсия или минус 80 градусов Цельсия. При подготовке к секционированию замороженных сообществ установите температуру криосекционной камеры на уровне минус 25 градусов Цельсия. Оставьте образцы в камере до тех пор, пока ее температура не достигнет температуры камеры.

Затем снимите фольгу с образца и отрежьте излишки ОКТ. Нанесите каплю ОКТ на криомонт и установите образец на криомонт. Равномерно распределите ОКТ по боковой стороне образца с помощью открытой фильтровальной бумаги Ватмана так, чтобы толщина ОКТ составляла два-три миллиметра.

Обеспечение запаса ОКТ в два-три миллиметра со всех сторон образца помогает сохранить целостность срезов. Дайте ОКТ застыть внутри криостатной камеры перед разделкой. Используйте боковые стороны блока образца OCT, чтобы выровнять образец по отношению к лезвию.

Если образец не выровнен по отношению к лезвию, секционирование начнется с угла или сбоку образца. Отрегулируйте крепление так, чтобы лезвие резало идеально вертикальную поверхность образца блока. Типичные для дрожжевых сообществ срезы имеют толщину около 14 микрометров.

После разрезания среза используйте предметное стекло микроскопа, хранящееся при комнатной температуре, чтобы собрать срез. Если медленно переместить предметное стекло к срезу, срез расплавится и перейдет в микроскоп. На одну горку можно перенести до 18 секций.

Перед визуализацией предметные стекла храните при низких температурах, желательно при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Потери сигнала минимальны при хранении в течение одной недели при температуре четыре градуса Цельсия для максимального флуоресцентного сигнала. Визуализация должна быть сделана сразу после разрезания.

Здесь представлены репрезентативные флуоресцентные изображения вертикальных сечений дрожжевых сообществ, выращенных в идентичных условиях. Сообщество состоит из двух фототропных штаммов визье, меченных флуоресцентными белками. Вишня M визуализируется как красный, а Y-E-G-F-P визуализируется как зеленая конкуренция за общие ресурсы, включая пространство, приводит к столбчатым узорам, отображаемым в их вертикальных поперечных сечениях.

Разрешения с точностью до одной ячейки могут быть разрешены в поперечных сечениях. На этом рисунке сравниваются поперечные сечения, полученные с фиксацией метанола, показанной на нижней панели, и без фиксации метанола, показанной на верхней панели. Флуоресцентный сигнал сохраняется в разделах сообщества без фиксации, но целостность сообщества нарушается.

В результате некоторые ячейки уплывают по краю разреза, и общий выход ниже по сравнению с фиксированными сообществами. Фиксация метанола удерживает клетки сообщества вместе, но вызывает усадку, что наблюдается при уменьшении высоты сообщества. На этом рисунке показаны репрезентативные светлые и флуоресцентные вертикальные срезы дрожжевого сообщества, состоящего из двух протопических штаммов визье, покрытых флуоресцентными белками DS RED и YFP.

Клетки на вершине сообщества образуют корону, которая отличается от материнских клеток, характеризуется более сильным рассеянием в светлом поле и более яркой флуоресценцией. Эти закономерности согласуются с известными моделями дифференциации в дрожжевых колониях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать криосекцию для изучения пространственных закономерностей флуоресценции в дрожжевых сообществах.