Выделение и анализ Brain-секвестрированных лейкоцитов из Plasmodium berghei ANKA-инфицированных мышей

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы изолировать адгезивные воспалительные лейкоциты из кровеносных сосудов головного мозга мышей, инфицированных Plasmodium burge Eye anca для индуцирования экспериментальной церебральной малярии. Мышей заражают Plasmodium berge eye anca паразитирующими эритроцитами путем инъекций. После того, как у мышей начинают проявляться признаки заболевания, циркулирующие клетки инфицированных малярией мышей удаляются с помощью внутриротовой перфузии.

Затем мозг собирают, а ткани переваривают ферментами, чтобы обеспечить выделение воспалительных лейкоцитов. Затем проводится многоцветная проточная цитометрия для иммунофенотипа. Анализ полученных данных с помощью секвестрированных лейкоцитов позволяет выявить процентное соотношение и абсолютное количество лейкоцитов, мигрирующих в мозг мышей, инфицированных малярией.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области патогенеза малярии, например, какой тип воспалительных клеток мигрирует к месту секвестрации паразита в мозге инфицированных животных при различных экспериментальных условиях. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение. Этапы перфузии сложны для изучения, так как они требуют как скорости, так и осторожности, чтобы не повредить какие-либо значимые кровеносные сосуды. Некоторые части этой процедуры продемонстрируют Лианна Мчич, техник для животных, мисс Виктория, Рик, аспирант, и доктор Лиза Аэз, постдок из моей лаборатории.

Начните этот протокол с заражения мышей P. berge eye и разморозьте криоконсервированную аликвоту P berge eye anca паразитируют на эритроцитах или ПБК, дав ей нагреться до комнатной температуры. Извлеките донорскую мышь возрастом от 8 до 12 недель из клетки и поместите ее на рабочую станцию. Возьмитесь за загривок шеи между указательным и большим пальцами.

Переверните мышь и введите от 100 до 200 микролитров Plasmodium berge eye в брюшную полость. Как правило, двум мышам-донорам вводят ПБК. После инъекции поместите мышей в клетку через четыре-пять дней после заражения.

Извлеките мышь-донор из клетки и поместите ее на рабочую станцию. Поместите каплю крови из хвостовой вены мыши на конец предметного стекла микроскопа с матовым торцом. Поместите второе предметное стекло под углом 45 градусов и верните его в каплю крови.

Как только кровь распространится по краю, равномерно протолкните ползунок распределителя по предметному стеклу микроскопа, чтобы кровь размазывалась. Дайте мазку высохнуть на воздухе, чтобы зафиксировать мазки крови. Погрузите предметные стекла в 100% метанол на 30 секунд.

Затем окрашиваем горки в свежеприготовленный ГИМ ЗА в течение 10 минут после окрашивания гим за, промываем горку проточной водой в течение 30 секунд. Дайте предметному стеклу высохнуть на воздухе, затем рассмотрите его под микроскопом с помощью 100-кратного масляного погружного объектива. Перечислите PRBC с точностью до тысячи эритроцитов и рассчитайте процент пара, если мышь-донор достигла требуемого уровня от 2,5 до 5%Парсит Соберите кровь у мыши-донора с помощью пункции сердца под наркозом или ретроорбитального кровотечения с помощью гепаринизированной микрогематокритной капиллярной трубки.

Растворите кровь в среде RPMI в конечной концентрации от одного умножить на 10 до шести PRBC на 0,2 мл на мышь. Учтите, что нормальный мышиный гематокрит составляет примерно от шести до 10 до девяти эритроцитов на миллилитр. Фактически, от восьми до 12 недель экспериментальный C 57 заставил шесть мышей ввести один раз по 10 до шестого PRBC в 0,2 миллилитра внутрибрюшинно, как и раньше.

Чтобы контролировать уровень зараженных мышей, подготовьте мазок крови, как и раньше. Para следует определять каждые два-три дня, начиная со второго или третьего дня после заражения, начиная с пятого дня. После заражения и далее.

Мыши ежедневно наблюдаются на наличие признаков тяжелой малярии, как только пара-уровень превышает 5%, а у мышей проявляются неврологические симптомы примерно на шестой день после заражения. Инфицированных мышей усыпляют путем вдыхания CO2 и немедленно перфузируют PBS, как описано в сопроводительном документе. Самым сложным аспектом этой процедуры является внутрисердечная перфузия.

Ряд советов по устранению неполадок изложен здесь: С мышью, прикрепленной к пенопластовой доске для препарирования. В лотке для препарирования. Протрите брюшную сторону 70% этанолом, затем с помощью больших ножниц и щипцов вскройте кожу вдоль средней линии, чтобы обнажить грудную полость, складку и приколите кожу в стороны.

Придерживайте грудину тонкими щипцами и разрежьте диафрагму и по обеим сторонам грудины, отрезав ребра. Будьте осторожны, чтобы не повредить крупные кровеносные сосуды. Закрепите грудную клетку за грудиной неплотно рядом с головой.

Удерживайте желудочки тонкими щипцами и осторожно разрежьте правое предсердие тонкими ножницами. Введите иглу 23 калибра, прикрепленную к системе гравитационной перфузии, в левый желудочек по направлению к восходящей аорте. Во время работы PBS введите всего 0,5 сантиметра кончика иглы и перфузируйте мышь в течение пяти минут или до тех пор, пока стоки не станут прозрачными.

После внутренней перфузии препарируйте мозг и поместите его в 10-миллилитровую центрифужную пробирку, содержащую RPMI. Терпимая. Поместите свежесобранный мозг на клеточный фильтр из нержавеющей стали размером от 40 до 60 меш в чашке Петри, содержащей от трех до пяти миллилитров среды для культуры тканей RPMI. Разрежьте ткани мозга на небольшие кусочки.

Затем с помощью хрустального поршня протолкните небольшие кусочки мозговой ткани через клеточный фильтр. Перенесите гомогенат мозга в 10-миллилитровую пробирку и центрифугируйте его при 250-кратном перегрузке в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После отжима выбросьте надосадочную жидкость и растворите гранулу в трех миллилитрах RPMI.

Среда, содержащая коллагеназу D и ДНК лебедя. Переворачиваем смесь в течение 30 минут при комнатной температуре. Удалите остатки клеток, пропустив смесь через нейлоновое сетчатое фильтр 70 микрон.

Затем инкубируйте на льду в течение пяти минут после инкубации в 10-миллилитровой пробирке. Осторожно наложите гомогенат мозга на семимиллилитровую 30%-ную подушку для вызова центрифуги при 400-кратном перегрузке на 20 минут при комнатной температуре с выключением. После выброса надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре эритроцитов для лизиса, буферизуйте и инкубируйте на льду в течение пяти минут.

Для лизиса адгезивные ПБК, которые не удаляются из мозга путем внутриротовой перфузии. Добавьте девять миллилитров RPMI для средней промывки ячеек и центрифугируйте при 250 умноженных на G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Ресуспензия в мозге изолированных лейкоцитов или BSL-содержащих гранул в 50-100 микролитрах среды RPMI и перенос клеток в микроцентрифугу для подсчета жизнеспособных клеток под микроскопом с помощью гемоцитометра и трианового синего исключения.

Через шесть дней после заражения можно восстановить от 20 000 до 100 000 BSL после того, как будет получено количество жизнеспособных клеток. Клетки подготавливают к анализу методом проточной цитометрии. Детали этой процедуры приведены в сопроводительном документе, но сначала кратко изложены здесь.

Все клетки, выделенные из каждого мозга, центрифугируются в микропробирке объемом 1,5 миллилитра и ресуспендируются в буфере для окрашивания с антителами, блокирующими CD 16 и CD 32. После 10-минутной инкубации на льду клетки промывают окрашивающим буфером, снова центрифугируют и ресуспендируют в окрашивающем буфере, содержащем флуоресцентные антитела против CD 4, против CD 8 против TCR и против NK 1.1. Клетки инкубируются на льду в течение одного часа, промываются с окрашиванием, буфером и центрифугой.

После спина клетки ресуспендируются в PBS и на проточном цитометре регистрируется от 5 000 до 10 000 событий. Полученные данные анализируются с помощью соответствующего программного обеспечения для проточной цитометрии. Популяции BSL были извлечены из мозга перфузированных мышей или мышей, инфицированных малярией, и наивных контрольных мышей и окрашены PE, анти-NK 1.1 и PC-антителами анти-TCR бета.

Эти точечные диаграммы отображают процентное соотношение NK-клеток, Т-лимфоцитов, NK-1.1-положительных TCR-положительных клеток и двойных отрицательных клеток. NK 1.1 отрицательный TCR у перфузированных или несросшихся, инфицированных малярией и наивных контрольных мышей согласуется с предыдущими результатами. Альфа-бета TCR положительные Т-клетки составляли высокую долю пула BSL в мозге перфузированных мышей, инфицированных малярией, на шестой день после заражения.

Эта популяция, по-видимому, была значительно недопредставлена в мозге животных, не подвергавшихся перфузии. Очевидное снижение частоты Т-клеток в мозге без перфузии было связано со значительно более высоким процентом и общим числом двойных отрицательных клеток у этих животных. Высокий процент и количество двойных отрицательных клеток в неперфузированном мозге были обнаружены не только у мышей, инфицированных малярией, но и в наивных контрольных группах, что позволяет предположить, что эти клетки являются невоспалительными лейкоцитами, присутствующими в кровеносных сосудах мозга, которые восстанавливаются вместе с воспалительными клетками, если не проводить внутрисердечную перфузию.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о проведении обширной интракардиологической терапии инфицированных мышей перед извлечением органов, чтобы избежать контаминации секвестрированных лейкоцитов невоспалительными циркулирующими клетками. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять и анализировать изолированные лейкоциты мозга у мышей, инфицированных плазмодием вирга, с помощью плавной геометрии.