Единичных измерений Сотовые вакуолярных разрыв под действием внутриклеточных патогенов

Мы опишем метод для отслеживания endomembrane вызванной разрывом внутриклеточных бактерий

В этом эксперименте отслеживается разрыв VA, вызванный внутриклеточными патогенами в отдельных клетках. Сначала загрузите в клетки краситель CCF 4:00 AM, который расщепляется клеточными эстеразами. Затем подготовьте и примените нейробактерии FL к CCF: четыре загруженные клетки инкубируют клетки при температуре 37 градусов Цельсия для бактериальной инвазии в клетки-хозяева.

Затем определите соотношение интенсивностей, излучаемых в каналах 450 и 535 нанометров. Результаты показывают присутствие патогенов в цитозоле из-за его приспособляемости к высокопроизводительному лизу. Этот метод облегчает идентификацию новых антибиотиков, решая ключевую проблему субклеточной локализации бактерий во время взаимодействия патогенов хозяина.

Вместе с моим коллегой Тран Вану мы были заинтересованы в разработке подходов к изучению внутриклеточных патогенов с высоким временным разрешением. Это привело к созданию регулярного анализа разрыва улярного волокна с четырьмя беталактамазами CCF. Сегодня этот подход будет экспериментально представлен двумя аспирантами в лаборатории, Норой Меллу и Шарлоттой Келлер. Инокулируйте дикий тип и мутантные штаммы бактерий в восемь миллилитров TCSB, содержащих 50 микрограммов на миллилитр ампициллина, поместите культуры в шейкер с температурой 37 градусов Цельсия, теперь засейте пять раз по 10 до третьего хела клеток в лунку.

В 100 микролитрах DMEM, содержащих 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллина стрептомицина культуры, клетки в 5%-ном инкубаторе углекислого газа на следующий день субкультуры бактерий при одном 100-м разведении в TCSB, дополненных 50 мкг на миллилитр ампициллина, выращивают в шейкере при 37 градусах Цельсия в течение двух с половиной часов. Теперь для загрузки хела клетки приготовьте CCF 4:00 AM краситель в эм буфере, промойте клетки один раз PBS. Затем добавьте 25 микролитров CCF 4:00 AM загружайте смесь на лунку при комнатной температуре в темноте в течение двух часов и 30 минут для подготовки бактерий к инфекции гранулы одного миллилитра культуры путем центрифугирования после одной промывки с 500 микролитрами PBS Resus, суспендируйте бактерии в 500 микролитрах PBS с добавлением 10 микрограммов на миллилитр полиоллизина и 40 микрограммов на миллилитр бета-лактамазы.

Инкубировать в течение 10 мкм на вращающемся колесе при комнатной температуре, затем один раз промыть 500 микролитрами PBS и повторно суспендировать каждую бактериальную гранулу в 500 микролитрах одного миллимолярного пробенецида в ЭМ-буфере. Далее разведите 10 микролитров бактерий в 100 микролитрах одного миллимолярного зондируемого раствора и распределите его по каждой лунке хела клеток. После 15 минут инкубации в темноте при комнатной температуре перенесите тарелку до 37 градусов Цельсия на один час.

Умойте один раз 150 микролитрами одного миллимолярного раствора пробита. Затем зафиксируйте образцы с 50 микролитрами 4%-ного параформного альдегида в одном миллимолярном растворе Pro на 10 минут в темноте После одной промывки раствором Probenecid добавьте 30 микролитров 10 микромолярного ядерного красителя drac five для оптимальной сегментации клеток. Инкубируйте клетки в течение 30 минут, промойте один раз и добавьте 100 микролитров одного миллимолярного раствора для получения изображений с помощью инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа.

Используйте длину волны возбуждения на 405 нанометрах. Обнаруживайте излучение с помощью фильтров 450 нм и 535 нм, используя время воздействия проходящего света в пять миллисекунд. 1000 миллисекунд для 535 нанометров и 500 миллисекунд для 450 нанометров.

Использование устройства калибровки фокуса в сочетании с автоматизированной микроскопией позволяет одновременно регистрировать десятки различных положений в нескольких скважинах. Если вы используете конфокальный микроскоп, то используйте время экспозиции 240 миллисекунд при 450 нанометрах, 360 миллисекунд при 535 нанометрах для 405-нанометрового лазера и 640 миллисекунд для 640-нанометрового лазера. Анализируйте данные с помощью компьютерного алгоритма, который позволяет автоматически оценивать флуоресцентный сигнал для каждой отдельной клетки.

Например, с помощью таких программ, как metamorph и acapella, можно создать скрипт для измерения отношения между сигналами излучения 450 нм и 535 нм. Для этого анализа начните посев HELOC с двух умножить на 10 до пятой клетки в конечном объеме два миллилитра. Подготовьте бактерии к инфекции и загрузите клетки hela с помощью CCF 4:00 AM, расположите конвоскоп с целью подачи воздуха в плане N внутри нагревательной камеры при температуре 37 градусов Цельсия.

Установите лазер 405 нм и излучение с помощью фильтров 450 нм и 535 нм. Также введите время экспозиции в пять миллисекунд для проходящего света. 200 миллисекунд для 535 нанометров и 100 миллисекунд для 450 нанометров.

Настройте сбор данных каждые 90 секунд в течение 60 минут. Теперь промойте клетки один раз двумя миллилитрами одного миллимолярного раствора Пробенецида. Добавьте два миллилитра одного миллимолярного проба в буфер em.

Затем установите чашку на столик микроскопа и приступайте к сбору данных через шесть минут. Отложите приобретение. Добавьте 250 микролитров ресуспензии бактерий поверх клеток и возобновите сбор для анализа после сбора.

Визуализируйте фильмы с помощью метаморфа Velocity или изображения J. Получите отношения интенсивности от 450 до 535 нанометров для каждой отдельной ячейки. Подход CCF 4:00 AM к бета-лактамазам является надежным и чувствительным методом отслеживания разрыва глаз внутриклеточных патогенов, таких как gel flexneri, при инфицировании клетками HELOC. При использовании неинвазивного штамма BS 176 AFA один в течение одного часа, четырехладовый зонд CCF остается неповрежденным и излучает зеленый сигнал.

Напротив, вирулентный штамм M 90 TFA I переключает сигнал в сторону синего в соответствии с расщеплением зонда в цитозоле для определения отношения метрического сигнала. Мы разработали скрипт для программного обеспечения metamorph и acapella для автоматизации обнаружения ячеек и измерений в каналах 535 и 450 нанометров. Ядра и цитозоль клеток сегментируются с помощью пятиканального канала DR.

Затем алгоритм способен обнаруживать и количественно определять 450 нанометровые и 535 нанометровые положительные клеточные популяции. Рассчитанные средние отношения являются низкими для мутантного штамма и высокими для вирулентного штамма. Эксперименты могут быть проведены на различных типах клеток человека, таких как эпителиальные клетки Gila и клетки, подобные одному макрофагу.

Оба типа клеток реагируют на вирулентный штамм M 90 T AFA one cha, переключая излучаемый сигнал с зеленого на синий при инфекции. При использовании неинвазивного штамма зеленый сигнал сохраняется при количественном определении с помощью скрипта, разработанного в программном обеспечении метаморфа, а макрос, разработанный в Excel, представляет гистограммы разрыва улярий в зависимости от распределения клеток. Метод может быть успешно адаптирован для понимания инфекционности различных бактерий.

Например, этот набор данных показывает микобактерии Bovis. БЦЖ находится в фагосоме в течение всего эксперимента, о чем свидетельствует постоянный зеленый сигнал. В отличие от этого, микобактерия туберкулеза вызывает разрыв мембраны блуждающего нерва в одном макрофаге ТГП через семь дней после заражения, о чем свидетельствует появление сигнала длиной 450 нанометров после семи дней заражения с использованием того же алгоритма.

Что касается изучения разрыва валаров у Ella, мы обнаружили, что клетки, инфицированные микобактерией туберкулеза, демонстрируют более высокие соотношения от 450 до 535 нанометров, чем у микобактерий bovis BCG после семи дней инфекции. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как изучать разрыв уляры патогенами с помощью анализа CCL на четыре беталактамазы После освоения этого протокола его можно выполнить за четыре часа, но помните, что вы должны добавлять процесс в каждый буфер на протяжении всего протокола. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как электронная микроскопия или мембранное фракционирование, заключается в том, что она может быть выполнена в режиме реального времени без каких-либо биохимических обработок.

Для оценки поглощения и пролиферации бактерий в клетках хозяина может быть проведен дальнейший анализ, такой как мечение актином или анализ защиты гентамицина.