Электропорации Hindbrain Трейс аксонов траектории и Synaptic Цели у эмбрионов кур

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы пометить определенные подмножества нейронов в заднем мозге цыпленка и проследить их аксональные траектории и мишени. Для этого сначала открывается маленькое овальное окошко в центре эмбрионального дня.2.75. Следующие плазмиды ДНК яйцеклетки вводятся в просвет заднего мозга.

Затем задний мозг в одностороннем порядке электропорируется, чтобы обеспечить экспрессию конструкций в желаемой группе нейронов, и яйца инкубируются. Наконец, ствол мозга препарируется из целого эмбриона для подготовки плоского крепления или разрезания ткани. В конечном счете, можно получить результаты, которые показывают аксональные проекции и синаптические мишени в заднем, мозге и мозжечке на различных стадиях развития с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания и микроскопического анализа.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии развития, например, как конкретные нейронные клетки проецируют свои аксоны и формируют синаптические связи во время эмбрионального развития. Чтобы подготовиться к электропорации, инкубируйте их при температуре от 37 до 38 с половиной градусов Цельсия в течение 65-70 часов, пока они не достигнут стадии от 16 до 17. Пока яйца инкубируются, потяните за стеклянные капилляры, соедините изогнутые Г-образные золотые электроды с переходником-держателем к импульсному диктору.

Установите параметры электропорации на 25 вольт, пять номеров импульсов, длину импульса 45 миллисекунд и 300 интервалов импульсов. Подготовьте ротовую пипетку, шприц-иглу на 10 миллилитров, полоски параформы, мягкую щетку, острые ножницы для препарирования и 25 миллилитров стерильного ПБС. Приготовьте адекватную смесь плазмид ДНК и добавьте быстрый зеленый краситель для визуализации введенной ДНК.

Когда яйца достигнут надлежащей стадии развития, извлеките их из инкубатора и держите в горизонтальном положении. Используйте 70% этанол для очистки яичной скорлупы. Обрабатывайте по одному яйцу за раз, чтобы свести к минимуму воздействие эмбриона.

Время проветривать кончиками ножниц. Сделайте отверстие на столбе яйца и с помощью шприца удалите три-четыре миллилитра альбумина. С помощью ножниц для препарирования откройте небольшое овальное окошко на верхнем горизонтальном полюсе яичной скорлупы.

В течение всего процесса капайте несколько капель PBS поверх эмбриона, чтобы предотвратить сухость. С помощью ротовой пипетки загрузите небольшое количество смеси ДНК в стеклянный капилляр. Далее поместите эмбрион его задним концом непрямым видом.

Затем, удерживая капилляр под углом около 45 градусов, проникнуть в заднюю часть мозга. Не удаляйте оболочку вокруг эмбриона без образования пузырьков воздуха. Осторожно выдохните, чтобы ввести раствор ДНК в просвет заднего мозга.

Раствор распространится спереди сразу после инъекции ДНК. Поместите параллельные электроды в точное целевое положение AP и DV заднего мозга. Не касаясь сердца, слегка надавите на электроды вентрально и пульсируйте электро.

Электроды должны быть покрыты пузырьками для обозначения электропроводности, осторожно снимите электроды и капните несколько капель PBS для охлаждения эмбриона и удаления пузырьков. Используйте полоску перфила, чтобы правильно закрыть отверстие для яйца, чтобы предотвратить высыхание во время инкубации с помощью мягкой щетки и PBS, промойте электроды, поместите яйцо в инкубатор на желаемое время. Выживаемость эмбрионов составляет примерно 90% через два-три дня после электропорации и снижается до 50% через 12 дней после электропорации.

Чтобы сделать плоский монтаж препаратов заднего мозга, тщательно препарируйте эмбрион, отделив его от окружающих оболочек и кровеносных сосудов. Поместите эмбрион в небольшую чашку Петри, покрытую силиконовым покрытием, содержащую PBS, так, чтобы эмбрион был обращен дорсально. С помощью вольфрамовых булавок прикрепите его к блюду.

Затем с помощью острого стеклянного капилляра. Сделайте дорсальный разрез в задней части крыши головного мозга с помощью острого пинцета и микроножниц. Возьмитесь за верхнюю часть головы и очень осторожно потяните заднюю мозговую ткань от рострального к точьму.

После отделения заднего мозга удалите оставшиеся вентральные ткани. Инкубируйте задний мозг в 4%-ном параформном альдегиде или растворе PFA в течение одного-двух часов при комнатной температуре. Затем промойте его PBT, чтобы удалить PFA.

После выполнения иммунофлюоресцентного препарата, описанного в текстовом протоколе, поместите задний мозг дорсально на предметное стекло. Добавьте флуоресцентную монтажную среду на задний мозг и используйте стеклянные капилляры или вольфрамовые иглы, чтобы расплющить задний мозг на предметном стекле. Добавьте небольшое количество смазки в каждый уголок, чтобы предотвратить сдавливание ткани покровным стеклом.

Осторожно наденьте чехол сверху на задний мозг, не допуская скопления пузырьков воздуха. Добавьте лак для ногтей на края стекла крышки. Криогенные срезы ствола мозга могут быть выполнены на любой стадии развития, даже после Е 6.5.

Они должны быть предпочтительным методом из-за сложности визуализации аксонов в плоском эмбрионе, который становится очень толстым. Кроме того, демонстрация синапса требует разреза ткани и большого увеличения под микроскопом. Чтобы подготовить образец для криосекции, препарируйте эмбрион и удалите все ткани, окружающие мозг.

Смойте PBS. Затем с помощью микроножниц и острого пинцета разрежьте эмбрион в области сердцевины мозгового вещества. Сделайте широкий разрез между мозжечком и средним мозгом и удалите весь ствол мозга.

Ткань должна содержать мозговое вещество pons и мозжечок. В следующем примере энхансерный элемент, который экспрессируется в DA одной подгруппе интернейронов в контрольном заднем мозге, был клонирован перед рекомбиназой Cree и совместно электропорирован с Cree-зависимой цитоплазматической репортерной плазмидой GFP. Препарирование плоского монтирования на стадии E 4.5 выявляет два контралатеральных восходящих паттерна аксональных проекций для картирования аксональных проекций интернейронов DA one на более поздних стадиях развития.

Репортерская кассета с безусловным условием GFP была клонирована между двумя спинными руками вместе с усилителем одного крина A TOH и вектором транспонирования. Используя эту стратегию, условный MG FP с электропорацией C precon интегрируется в хромосомы цыпленка и, следовательно, стоп-кассета удаляется только в нейронах Done, что обеспечивает пролонгированную экспрессию GFP. В DA одна ячейка.

Мезилированная форма GFP привязывает его к мембране таким образом, что он локализуется вдоль аксональной мембраны, а не разбавляется в цитоплазме. В мозге стебли собраны в точке Е 13.5 и проанализированы в сагиттальных срезах. Было обнаружено, что аксоны DA one накапливаются в мозжечке и распространяются в направлении внешнего зернистого слоя или EGL, который отмечен положительными клетками ZI one.

Также были проанализированы синаптические мишени аксонов Done в мозжечке. Эмбрионы E 2.75 подвергали электропорации с помощью двухрепортерной плазмиды синаптического везикулярного белка вместе с энхансером H one Cree и транспонированными транспонами. Этот метод позволяет экспрессировать репортер GFP в пресинаптической DA на одном аксональном конце.

Мозжечок был разрезан в точке Е 13,5 и окрашен общим пресинаптическим маркером синаптическим таманом, а также кальбиндином, которым обозначается слой бикини. Изображение среза с большим увеличением демонстрирует SV два GFP-положительных синаптических везикулы в нескольких областях мозжечка, включая слой бикини. Этот результат выявляет синаптические связи DA одного заднего мозга в интернейронах в мозжечке.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как провести электрооперацию ДНК в организм птицы Hein на второй день эмбриона в точке 75, чтобы специфически пометить подмножество нейронных клеток. Эта процедура позволяет проследить аксональные проекции и синаптические связи меченых нейронных клеток на разных стадиях развития.