Multi-единицы Запись методы для характеристики нейронной активности в Locust ( Schistocerca Americana) Обонятельные схемы

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы зарегистрировать отозванную запахом нейронную активность нескольких единиц из первых трех центров обработки сигналов обонятельного пути насекомых. Это достигается путем предварительного удержания саранчи в специально разработанной камере и стабилизации одной из ее антенн для электрофизиологических записей. Второй шаг заключается в изготовлении стеклянного микроэлектрода и вставке его в основание солнца для мониторинга вызванных запахом реакций.

Далее нужно записать нейронную активность от мозга саранчи. Затем следует многоступенчатая процедура диссекции, чтобы обнажить нервную ткань, которая обрабатывает входные данные от обонятельных сенсорных нейронов. Заключительный этап включает в себя соответствующее размещение многоэлектродных матриц для регистрации ансамбля нейронной активности саранчи и лепестка антенны, а также тела гриба.

В конечном счете, продемонстрированные здесь методы внеклеточной записи используются для характеристики реакций, вызванных запахом, в первых трех процессинговых центрах вдоль обонятельного пути насекомых. Хотя этот метод был использован для характеристики вызванной запахом нервной реакции в относительно простой обонятельной системе беспозвоночных, он также может быть адаптирован для изучения ансамблевой активности и в других нейронных системах. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что некоторые ключевые аспекты этой процедуры, такие как установка электродов и некоторые этапы диссекции, очень сложны для изучения.

Кроме того, методы в основном качественные, и разные лаборатории совершенствовали их по-разному с течением времени. Чтобы начать эту процедуру, выберите молодую взрослую саранчу любого пола с полностью взрослыми крыльями, но до стадии спаривания из переполненной колонии. Далее обуздайте саранчу, ампутировав ей ноги.

Заклейте места ампутаций тканевым клеем. Затем закрепите саранчу в специально разработанной камере с помощью небольшого кусочка изоленты, обернутого вокруг ее грудной клетки. Под микроскопом для препарирования сделайте в восковой площадке неглубокую канавку для размещения антенны.

Поместите антенну в канавку и стабилизируйте ее с помощью воска бати на двух концах антенны. После этого вставьте в грудную клетку заземляющий электрод. Используйте воск батик, чтобы запечатать место разреза и удержать заземляющий провод на месте.

Далее поместите стабилизированную антенну саранчи под стереомикроскоп на виброизоляционный стол. Подсоедините выпускные линии бутылок с запахом к трубке подачи запаха. Расположите трубку подачи запаха в нескольких сантиметрах от антенны, пары подаваемого запаха удаляются вакуумной воронкой, расположенной примерно в 10 сантиметрах позади антенны саранчи.

Затем изготовьте стеклянные электроды с помощью бора кремниевого стеклянного капилляра с микропипеткой, полярно заполните стеклянный электрод солевым раствором акации. Затем поместите стеклянный электрод в держатель микропипетки, который прикреплен к моторизованному микроманипулятору. Убедитесь, что основа записывающего синуса хорошо видна под микроскопом.

Аккуратно вставьте электрод в основание синуса. Впоследствии усилите сигнал в 10 000 раз. Использование усилителя переменного тока.

Отфильтруйте сигнал в диапазоне от 0,3 до 10,0 килогерц и получите его с частотой дискретизации 15 килогерц. С помощью системы сбора данных, когда электрод расположен правильно, можно обнаружить спонтанную нейронную активность. Вызванные стимулом реакции можно контролировать, подавая импульс запаха через трубку подачи запаха.

При расположении близко к антенне и отслеживании изменения внеклеточной активности, следованию ограничивающим процедурам, описанным ранее. Поместите саранчу в специально разработанную камеру. Начните процесс вскрытия с создания восковой чаши вокруг головы саранчи.

Постройте две восковые башни по обе стороны от головы саранчи, достигающие высоты усиков. Далее вставьте каждую антенну через небольшой кусочек полиэтиленовой трубки, который плотно прилегает к резиновой прокладке. Затем прикрепите прокладки к восковым колоннам таким образом, чтобы пластиковая трубка могла свободно скользить к основанию антенны или от него, предотвращая при этом движение антенны.

Затем под микроскопом начните строить восковую чашу вокруг головы саранчи, чтобы обеспечить перфузию физиологическим раствором во время и после процедуры вскрытия. Восковая чаша должна начинаться чуть выше ротовых частей, охватывать обе восковые башни и выходить за пределы сложных глаз. После того, как восковая чашка будет полностью изготовлена, прикрепите основание антенны к нижнему концу пластиковой трубки с помощью эпоксидной смолы.

Это гарантирует, что усики останутся на месте даже после удаления окружающей кутикулы. С этого момента держите восковую чашку наполненной физиологическим раствором. Теперь удалите центральную прямоугольную область между ними.

Антенна. Впоследствии удалите кутикулу в соседних областях, не нарушая сложных глаз или кутикулу у основания усиков. С помощью тонких щипцов аккуратно удалите воздушные мешки и жировые тела, окружающие мозг.

Мозг саранчи теперь должен быть хорошо виден. Области мозга, которые обрабатывают обонятельную информацию, расположены между ними. Усики аккуратно вытяните за кишку и разрежьте ее с помощью тонких ножниц.

Затем удалите крылья и сделайте небольшой разрез в области живота чуть выше прямой кишки. Удалите кишку, вытянув заднюю кишку грубыми щипцами. Этот шаг гарантирует, что движение кишечника не дестабилизирует препарат.

Для предотвращения утечки физиологического раствора. Завяжите живот прямо перед местом разреза шовными нитями. Затем используйте небольшую платформу, сделанную из тонкой проволочной петли, покрытой тонким слоем воска, чтобы поднять мозг и стабилизировать его для электрофизиологических сил.

Записывающий мозг защищен полупрозрачной оболочкой, которую необходимо снять перед записью. Чтобы ослабить оболочку, частично слейте воду из восковой чашки и аккуратно распределите небольшое количество протеазы по поверхности мозга. Примерно через пять-10 секунд применения ферментов тщательно промойте мозг физиологическим раствором.

Затем очень осторожно зажмите и потяните тубу вверх с помощью супертонких щипцов, чтобы разорвать его и обнажить места записи. В этой процедуре препарат от саранчи помещают под стереомикроскоп на виброизоляционный стол. Поддерживайте постоянную скорость перфузии солевым раствором около 40 миллилитров в час.

На протяжении всего эксперимента используйте хлоридную серебряную проволоку, погруженную в наполненную физиологическим раствором восковую чашку, в качестве заземляющего электрода. Подготовьте настройку доставки запаха, аналогичную эксперименту с записью одного датчика. Перед началом эксперимента нанесите на электроды гальваническое покрытие золотом, чтобы достичь импедансов в диапазоне от 200 до 300 кг.

Используйте 16-канальный кремниевый зонд для записи основных нейронов. Под микроскопом. Расположите электрод близко к поверхности лепестка антенны и аккуратно введите его в ткань с помощью ручного микром-манипулятора в идеальном месте записи, внеклеточные сигналы будут улавливаться несколькими каналами записи и будут иметь высокое соотношение сигнал/шум.

Для записи клетки Кеньон используется изготовленный на заказ теропластик с витой проволокой, который следует процедуре гальванического покрытия. Затем силиконовый зонд помещает теро на поверхность тела гриба. Поскольку самарские кенийские клетки ограничены поверхностным слоем этой области, записи как основного нейрона, так и кенийских клеток могут быть сделаны одновременно из одного и того же препарата саранчи.

После определения места записи подождите не менее 15 минут, чтобы обеспечить стабилизацию электродов. Затем получают внеклеточный сигнал на частоте 15 килогерц. Отфильтруйте его в диапазоне от 0,3 до шести килогерц и усилите с помощью 16-канального усилителя переменного тока, как спонтанного, так и вызванного стимулом.

Можно наблюдать многоединичную нейронную активность проекционных нейронов в лепестке антенны. Необработанные внеклеточные следы напряжения, показывающие реакцию нейронов обонятельных рецепторов на два различных запаха. Здесь показаны два восьмеричных и один H-этанол.

Здесь показана репрезентативная внеклеточная трассировка из записи лепестков антенны с помощью нескольких единиц. В этой трассировке напряжения можно наблюдать потенциалы действия или спайки различной амплитуды, исходящие от нейронов с различными принципами. Обратите внимание, что четырехсекундный импульс запаха был применен в течение периода времени, указанного серым прямоугольником.

Пример внеклеточной записи тела гриба показан здесь. В отличие от нейронов обонятельных рецепторов и основных нейронов, клетки Кеньона в теле гриба насекомого имеют более низкую базовую активность и реагируют на запахи разреженным и избирательным образом. Чтобы изолировать одиночные отклики от этих многоединичных записей, мы выполняем процедуру сортировки спайков с использованием опубликованного программного обеспечения в автономном режиме.

Примеры принципиальной сортировки нейронов и шипов кенийских клеток показаны здесь После просмотра этого видео. Должен хорошо понимать, как выполнять внеклеточную мультиюнитовую запись для характеристики ансамблевой нейронной активности в первых трех обонятельных центрах вдоль обонятельного пути вставки.