В Vivo Двухфотонные изображений зависящие от опыта молекулярные изменения в корковых нейронов

Переживаемые зависимые молекулярные изменения в нейронах имеют важное значение для способности мозга адаптироваться в ответ на поведенческие вызовы. Здесь описан метод визуализации с двумя фотонами in vivo, который позволяет отслеживать такие молекулярные изменения в отдельных нейронах коры головного мозга с помощью генетически закодированных репортеров. Одним из хорошо известных зависимых генов является активность, регулируемая цитоскелетно-ассоциированным белком или дугой.

Транскрипция ARC быстро и в значительной степени индуцируется усиленной нейронной активностью Чтобы обеспечить возможность изучения экспрессии дуги в живых нейронах с помощью двух фотомикроскопий, мы используем мышиную линию, в которой репортер GFP помещен под контроль эндогенного промотора дуги. Этот протокол описывает хирургическую подготовку и процедуры визуализации для отслеживания паттернов экспрессии GFP зависимой дуги в нейронных ансамблях у живого животного. Во-первых, мы опишем подготовку животных, необходимую для этой техники.

Животное с дуговым GFP будет подвергаться операции на черепном окне и восстанавливаться после операции в течение примерно двух недель. Затем проверяется качество черепного окна, и если через него можно визуализировать нейроны, животное помещается в среду qua до начала экспериментов по поведенческой и двухфотонной визуализации. Затем эти животные многократно визуализируются с помощью двух фотомикроскопических изображений.

После того, как желаемые поведенческие парадигмы будут сформированы в течение нескольких дней, очистите все инструменты в стерилизаторе для горячих шариков. Перед асептической операцией очистите место операции 70% этанолом и положите чистые салфетки. Обезболите животное 1,2% раствором Эвертона, вводимым в дозе 0,02 миллилитра на грамм внутрибрюшинно.

Проверьте уровень анестезии с помощью щипков для хвоста или пальцев ног, чтобы обеспечить полную седацию. Закройте глаза животного стерильной офтальмологической мазью и введите подкожно Дексаметазон 0,2 миллиграмм на килограмм и карпрофен пять миллиграмм на килограмм. Сбрейте шерсть над черепом между ушами и простерилизуйте кожу с помощью скраба Бетадина и трех чередующихся тампонов с содержанием этанола 70%, установите животное на стереотаксическую хирургическую стадию с ушными планками с циркуляцией воды грелкой под животным, установленной под углом 37 градусов.

Регулярно проверяйте уровень анестезии у животного и при необходимости добавляйте первоначальную дозу анестетика. Введите 200 микролитров 0,5% маркаина под кожу головы, чтобы обезболить область, надрезать кожу и удалить кожный лоскут над черепом. Удалите надкостницу и высушите участок чистыми ватными тампонами.

Используйте высокоскоростную стоматологическую бормашину с заусенцем 0,5 миллиметра, чтобы аккуратно очертить круг диаметром от трех до пяти миллиметров над интересующей областью мозга в зависимости от ваших потребностей. Периодически смачивайте место сверления стерильным 0,9%-ным физиологическим раствором и очищайте костную пыль чистыми ватными тампонами. Если кость кровоточит, используйте гелевую пену, предварительно смоченную стерильным физиологическим раствором, чтобы промокнуть кровотечение и дождитесь его остановки.

Когда будет достигнут последний костный слой, поднимите и удалите костный островок с помощью щипцов с тонким наконечником. Вы можете столкнуться с твердыми мозговыми оболочками на нижней полке кости. Если на окне пересечены костные швы, их следует аккуратно снять.

Когда костный лоскут будет поднят, аккуратно накатайте влажную и гелевую пену на открытую твердую мозговую оболочку, чтобы очистить ее поверхность, и подождите, пока кровотечение из твердой мозговой оболочки не остановится. Если интересующий вас регион находится в месте с особенно толстой твердой мозговой оболочкой, может потребоваться удаление твердой мозговой оболочки над ней. В этом случае аккуратно отделите твердую мозговую оболочку от PIA ниже с помощью очень тонких щипцов.

Сделайте небольшой разрез в подтянутой твердой мозговой оболочке с помощью еще одной пары тонких щипцов. Затем возьмитесь за обрезанные края и аккуратно расколите твердую мозговую оболочку. Твердая мозговая оболочка тонкая, но прочная, поэтому будьте осторожны, чтобы не разрезать мозг неповрежденными краями твердой мозговой оболочки.

Когда вы работаете в сторону от интересующей вас области, обильно промойте эту область стерильным ликвором А или стерильным физиологическим раствором. Если окружающий череп значительно изгибается вокруг обнаженной твердой мозговой оболочки или пиа, используйте быстродействующий клеевой клей, чтобы заполнить пространства, которые не будут плотно соприкасаться со скользящей оконной крышкой в областях, которые не будут визуализированы. Затем наложите стерильную стеклянную крышку аккуратно на твердую мозговую оболочку или пиа.

Используйте акриловый гель Sano, чтобы покрыть эластомерный клей и края стекла. Чехол крышки. Покройте весь открытый череп цианоакрилатным гелем Sano или сумасшедшей смесью клея и стоматологического цемента.

Вставьте изготовленную на заказ металлическую планку для фиксации головы на противоположном конце черепа. Верните животное в теплую восстановительную камеру после внутрибрюшинной инъекции кетопрофена пять миллиграммов на килограмм для обезболивания. Продолжайте принимать анальгетик в течение двух дней после операции.

После двух недель послеоперационного восстановления обезболите животное фтором ISO. 5% для индукции, 1,5% для поддержания. Установите его на изготовленный на заказ предметный столик для микроскопа с рамкой для фиксации головки и проверьте краниальное окно на оптическую прозрачность.

При освещении синим светом поверхность мозга прозрачность кровеносных сосудов в высшей степени свидетельствует о качестве черепного окна. Если их края четко очерчены, то окно, скорее всего, будет пригодным для использования. Прежде чем приступить к поведенческому протоколу, животное должно содержаться в постоянной домашней клетке, чтобы свести к минимуму ежедневные изменения.

В исходной дуге уровни экспрессии GFP начинают поведенческую тренировку или парадигмы стимуляции окружающей среды в зависимости от интересующей области мозга. Например, животные могут подвергаться воздействию различных визуальных сред в течение нескольких дней подряд для получения изображений различных популяций нейронов в дуге зрительной коры, флуоресценция GFP в нейронах обычно достигает своего пикового уровня через два часа после стимуляции. График эксперимента может быть оптимизирован для облегчения обнаружения экспрессии ARC GFP в нейронах на их пиковых уровнях флуоресценции.

После завершения сеанса поведенческой тренировки или стимуляции окружающей средой обезболите животное фтором ISO 5% для индукции, 1,5% для поддержания. Установите животное в изготовленный на заказ предметный столик для микроскопа с рамкой для фиксации головы. Под двухфотонным микроскопом положение головы животного фиксируется на рамке для фиксации головы, которая соединяется непосредственно со сценой с помощью имплантированного металлического стержня на черепе.

ISO фтор и кислород непрерывно подаются к мыши через носовой конус. Температура тела поддерживается с помощью грелки. Убедитесь, что детекторы микроскопа защищены от окружающего света.

Проводя двухфотонное лазерное сканирование в темной комнате, используйте для визуализации водную иммерсионную линзу с числовой апертурой 20 x или 25 x 1,05. Во-первых, при эпифлуоресцентном освещении получите изображение поверхностных узоров кровеносных сосудов над интересующей областью мозга с помощью ПЗС-камеры. Для дальнейшего совмещения изображений запустите двухфотонное лазерное сканирование, чтобы получить стек 3D-изображений.

Длина волны возбуждения двухфотонного лазера установлена на уровне 920 нанометров, а мощность — примерно на 50. Излучаемая флуоресценция в милливаттах одновременно обнаруживается как в зеленом, так и в красном канале дуги. Флуоресценция GFP проявляется только в зеленом канале, в то время как тканевая автофлуоресценция проявляется в обоих каналах.

Типичные стеки изображений имеют размеры примерно 320 на 300, 20 на 100 микрометров, горизонтальное разрешение 0,5 микрометра на пиксель и вертикальное разрешение три микрометра на пиксель. После получения стека изображений верните животное в его домашнюю клетку. Не беспокойте животное до следующего сеанса поведенческой и визуализации.

Повторяйте процедуру моделирования и визуализации в течение нескольких дней по мере необходимости. Используйте ранее полученное изображение кровеносного сосуда на поверхности мозга, чтобы сориентироваться обратно в то же место визуализации. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет изучать изменения экспрессии дуговых генов в одном и том же наборе нейронов в течение нескольких дней.

У живого животного. Стандартные гистохимические методы позволяют достичь разрешения одной клетки, но не могут отслеживать изменения экспрессии генов в одних и тех же нейронах в течение нескольких дней. Другие методы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография или ядерная визуализация, не имеют разрешения для визуализации отдельных нейронов.

Таким образом, никакие другие существующие методы измерения изменений экспрессии генов не могут сравниться как с пространственным разрешением, так и с временным охватом описанного здесь метода визуализации. Важным этапом в этой процедуре является хирургия черепного окна. Его следует выполнять с особой осторожностью, чтобы избежать травмирования головного мозга или оставления крови под стеклом.

При необходимости твердая мозговая оболочка может быть удалена. Имейте в виду, что максимальная глубина визуализации в мозге при использовании этой процедуры будет зависеть от четкости краниального окна, настройки микроскопа и яркости флуоресцентных репортеров. Этот протокол визуализации in vivo является эффективным и универсальным методом получения информации о молекулярной динамике, связанной с нейропластичностью, в отдельных нейронах в ответ на различные поведенческие переживания и, вероятно, будет в целом применим к трансгенным мышам, несущим флуоресцентные репортеры для других испытанных регулируемых генов.