Изоляция и Иммуноокрашивание лимфоциты и дендритные клетки из мышиных Патчи Пейера

Общая цель этой процедуры заключается в выделении и иммуноокрашивании лимфоцитов и дендритных клеток из нейронных патчей с использованием двух параллельных экспериментальных подходов. Во-первых, отсечь свежие пластыри у мыши, тонкой кишки. Затем физически диссоциируйте участки плательщика, соберите ткань и пропустите ее через сетчатый фильтр для создания суспензии одной клетки для анализа проточной цитометрии.

Соберите клетки центрифугированием и распределите аликвоты в 96-луночной круглой нижней пластине. Затем пометьте клетки антителами против маркеров поверхности конкретного типа клеток. Немедленно приступайте к проточному цитометрическому анализу для перечисления конкретных типов клеток.

В ОКТ-блоках, криосекции, образцы помечаются антителами против маркеров поверхности конкретного типа клеток, а затем визуализируются с помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии, взятых вместе. Эти методы позволяют количественно оценить В-клетки, Т-клетки и дендритные клетки в определенных компартментах в тканях патча плательщика. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что ткани пластыря PI чрезвычайно хрупкие и могут быть легко повреждены.

Во время обработки. Положите только что изолированный тонкий кишечник на подстилку из влажных бумажных полотенец или салфеток Кима. Затем аккуратно смочите тонкую кишку физиологическим раствором, чтобы предотвратить обезвоживание тканей.

Теперь визуально идентифицируются отдельные патчи, расположенные на антибрыжеечной стороне кишечника. Как правило, одна мышь имеет от пяти до 10 видимых участков, которые равномерно распределены от двенадцатиперстной кишки до подвздошной кишки. С помощью изогнутых хирургических ножниц обычно вырезают индивидуальные пластыри плательщика.

Поместите их в холодный сортировочный раствор Хэнка Баланса, поддерживая в ткани четыре градуса Цельсия для сохранения жизнеспособности клеток. Далее переложите пластыри плательщика в пять миллилитров среды для диссоциации селезенки и встряхните при 250 оборотах в минуту в течение 15-20 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем, чтобы получить суспензию для одной клетки, поместите образец на стерильное сетчатое сетчатое сетчатое фильтр размером 70 микрон и принудительно измельчите ткань в сетку с помощью основания поршня из однокубового шприца, чтобы удалить оставшиеся клеточные агрегаты.

Сцедите клеточную суспензию через вторую ячейку 70 микрон, ситечко и соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 или 50 миллилитров. Дозируйте от 10 до пяти ячеек на лунку в 96-луночный пеллетный элемент с круглым дном путем центрифугирования в течение пяти минут 1000 раз. G. Затем сцедите надосадочную жидкость, осторожно перевернув пластину.

Теперь повторно суспендируйте клетки в буфере блока FC и инкубируйте на льду в течение 15 минут. Затем добавьте фторконъюгированные антитела непосредственно в клеточные суспензии в желаемом разведении и инкубируйте на ячейках для промывки льда со 100 микролитрами проточного буфера. Затем ресуспендируют клетки в 400 микролитрах фиксирующего буфера для анализа клеток методом проточной цитометрии для выделения патчей для криосекции.

Отрежьте 0,5 сантиметра поперечных сегментов тонкой кишки, содержащих один пластырь. Перенесите салфетку в чашку Петри, содержащую PBS. Затем поместите сегменты кишечной ткани вертикально внутрь форм-оснований, содержащих ОКТ.

Погрузите формы в жидкий азот и дайте ткани полностью замерзнуть. Удалите замерзшие формы основания из жидкого азота с помощью щипцов. Дайте форме нагреться при комнатной температуре ровно столько, сколько нужно, чтобы края блока OCT размягчились.

Затем выньте застывший блок ОКТ из формы. Переверните форму и осторожно надавите на заднюю часть, чтобы вытолкнуть блок на чистый кусок алюминиевой фольги размером четыре на четыре сантиметра. Немедленно заверните ткань в фольгу и поместите в маркированный пакет для образцов, хранящийся в жидком азоте или на сухом льду в крио-срезе ткани с помощью криомикротома LI a CM 3 0 5 0 s или эквивалента.

Установите температуру камеры на криостате на отметку минус 21 градус по Цельсию. Идеально резать участки толщиной от 12 до 14 микрон. Соберите срезы на предметные стекла для стеклянного микроскопа Supercross plus.

Осмотрите образцы визуально с помощью стандартного маломощного светового микроскопа. Погрузите горки в ацетон на две минуты. Имейте в виду, что длительная инкубация может привести к отделению тканей от предметного стекла.

Промойте образцы три раза PBST. Затем обведите участки изображением гидрофобной ручкой. Теперь инкубируйте образцы в блочном буфере, обложите срезы тканей первичным раствором антитела.

Высушите область вокруг участков салфетками Kim или другой впитывающей тканью, не касаясь самих участков ткани. С помощью пипетки или пипетки аккуратно поместите каплю золотого монтажного средства непосредственно на секцию. Наклейте защитный слой для стекла, избегая образования пузырьков воздуха и промокнув излишки крепления.

Средний факсимильный анализ монодисперсных суспензий патч-клеток с общим количеством пайеров показывает четкое различие между хорошими и плохими клеточными препаратами в хороших клеточных препаратах. Обладая жизнеспособностью более 80%, подавляющее большинство ячеек демонстрируют высокий прямой разброс, указывающий на большой объем ячеек, и низкий боковой разброс, согласующийся с низкой зернистостью ячеек. В этом эксперименте плохая подготовка клеток была специально подготовлена, чтобы продемонстрировать, что в плохой популяции большинство клеток демонстрируют низкий FSC, высокий SSC и находятся за пределами указанной походки R.

Эти клетки, вероятно, подвергаются апоптозу и/или некрозу. Здесь коктейль из четырех различных Fluor. Четыре конъюгированных моноклональных антитела для различения различных типов клеток.

В пайтерах использовали суспензии одиночных клеток, мечение кластером маркеров дифференцировки. CD 19 и B two 20 показывают, что B-клетки составляют около 60% плательщиков. Субпопуляции Т-клеток, специфичные для популяции патч-клеток, могут быть легко перечислены с помощью двойного мечения антителами против CD 3 и CD 4, или CD 3 и CD 8, CD 4 положительные и CD 8 положительные Т-клетки составляют примерно 23% и 9% соответственно от общего числа плательщиков патч-клеток.

Подмножества DC, они будут CD 11 C положительным и CD 1 0 3 положительным, также могут быть перечислены с помощью этого метода. CD 11 C положительные DCS составляют около 8% от общего числа закрытого населения, что примерно эквивалентно 10 000 DCS на один платный участок. Среди популяции CD 11 C положительных клеток примерно 4,7% были дважды положительными на B two 20 положительные.

Аналогичные результаты получаются при сборе патчированных клеток от черных шести мышей C 57. Плохая подготовка клеток может привести к весьма вводящим в заблуждение результатам, в основном потому, что мертвые или умирающие клетки имеют тенденцию связывать антитела неспецифически. Как правило, это приводит к чрезмерному представительству B 2 2 0 положительных и CD трех положительных двойных положительных клеток, а также B двух 20 положительных B-клеток и CD четырех положительных Т-клеток двойных положительных клеток.

Криосекции пластыря мышей поддаются гистопатологическому анализу, а также иммуномаркированию. В то время как сила сечений in обеспечивает большее разрешение на клеточном уровне при окрашивании h и e, светлые и темные зоны зародышевых центров патчей пайтеров легче разграничить в секциях криосеков. В этом типичном для плательщиков пластыре крио секция, анти CD три антитела, маркировка Т-клеток против антител CD 11 C.

Выделяют дендритные клетки и анти В два 20 антитела. Выделите В-клетки после его развития. Этот метод проложил путь исследователям в этой области, чтобы понять, как конкретные типы клеток, такие как дендритные клетки в лимфоидных тканях, связанных с кишечником, реагируют на кишечные антигены и микробные патогены.

Эта информация повлияла на дизайн и разработку вакцины для слизистых оболочек.