Оценка Полимерные доставки генов наночастиц наночастиц Анализ отслеживания и высокой пропускной проточной цитометрии

Общая цель данной процедуры заключается в проведении и оценке экспериментов по доставке генов с использованием невирусных полимерных наночастиц. Это осуществляется путем первоначальной трансфекции клеток частицами доставки генов. Затем эффективность трансфекции оценивается с помощью микроскопии и высокопроизводительного анализа методом проточной цитометрии.

Затем с помощью прибора для анализа траекторий наночастиц определяют распределение наночастиц по размеру, их концентрацию и количество плазмид на одну частицу. В конечном счете данный метод позволяет охарактеризовать размер наночастиц и оценить эффективность трансфекции с их использованием. Основным преимуществом использования биоразлагаемых полимерных наночастиц для доставки генов является то, что они могут быть более безопасными и эффективными, чем другие методы переноса генов.

Основным преимуществом анализа трекинга наночастиц по сравнению с существующими методами, такими как динамическое рассеяние света, является то, что анализ трекинга наночастиц позволяет напрямую определить среднечисленное распределение и концентрацию частиц. Этот метод поможет ответить на ключевые вопросы в области невирусной доставки генов, например, о количестве плазмид на одну частицу, что важно для исследований коэкспрессии. Следующий протокол продемонстрирован с использованием эндотелиальных клеток сетчатки человека (hre) в качестве модельных клеток и поли-бета-аминоэфиров (PBA AEs) в качестве модельных полимеров.

Обратите внимание, что условия культивирования и растворители может потребоваться скорректировать в зависимости от используемых клеток и полимеров за 24 часа до трансфекции. Используйте многоканальный дозатор для посева клеток в прозрачные 96-луночные планшеты с плоским дном, обработанные для культивирования тканей, при концентрации от 25 до 50 клеток на µL.

Это обеспечит 70–80% эффективности трансфекции в день процедуры; подготовьте и промаркируйте прозрачные 96-луночные планшеты без специального покрытия для культивирования тканей, которые будут служить мастер-планшетами для приготовления и разведения PBA и ДНК. Необходимо подготовить два идентичных планшета.

Один образец — для оценки токсичности, другой — для оценки эффективности трансфекции. Используйте стоковые растворы полимера poly beta amino ester (PVAE) и P-E-G-F-P-N 1D NA при комнатной температуре. После перемешивания с помощью 12-канального дозатора подготовьте в каждой лунке 50 µL ДНК в концентрации 0,06 mg/mL в 25 mM натрий-ацетатном буфере для каждого условия.

Затем на той же планшете разведите полимеры PBAE до концентрации 10 mg/mL в натрий-ацетатном буфере. Далее разведите полимеры PBAE до соотношений веса полимера к весу ДНК 30 и 60 в 50 µL натрий-ацетатного буфера. Для формирования наночастиц с помощью 12-канального дозатора смешайте 50 µL разведенного PBA с 50 µL разведенной плазмидной ДНК, интенсивно перемешивая путем многократного аспирирования и экспульсии жидкости.

Затем инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 10 минут для обеспечения самосборки. После самосборки с помощью 12-канального дозатора по каплям добавьте по 20 µL раствора наночастиц в каждую лунку с посеянными клетками, содержащими среду; трансфецируйте четыре лунки для каждого условия, как показано на данной схеме. Для каждого планшета выделите не менее четырех лунок для отрицательного и положительного контролей.

Отрицательный контроль состоит из необработанных клеток, а положительные контроли — из клеток, трансфецированных коммерчески доступным реагентом, таким как lipo 2000 или Fuge hd. Инкубируйте планшеты с трансфецированными клетками при 37 °C в течение четырех часов. После инкубации с помощью 12-канального дозатора удалите среду из лунок и замените ее 100 µL свежей среды hre на каждую лунку. Инкубируйте в течение дополнительных 24–48 часов.

На следующий день извлеките один планшет из инкубатора. Оцените эффективность трансфекции и токсичность клеток с помощью флуоресцентной микроскопии, а также количественно определите токсичность клеток с использованием анализа CellTiter-96 AQ, как описано в сопроводительном тексте. Через 48 часов извлеките из инкубатора второй планшет.

Оцените эффективность трансфекции с помощью флуоресценции, микроскопии и проточной цитометрии, как описано в сопровождающем тексте. Используйте полученные данные о токсичности и трансфекции для определения оптимальных концентраций PBA для последующих экспериментов. NanoSight NS 500 представляет собой прибор для анализа траекторий наночастиц, который позволяет получить информацию о распределении наночастиц в образце по размеру путем отслеживания диффузии отдельных наночастиц; перед использованием промойте гидравлическую систему NanoSight, используя микроцентрифужную пробирку объемом 0.5 мл.

Подготовьте PBA и плазменную ДНК для анализа, как и ранее, используя те же концентрации, что и в предыдущем разделе этого видео. После самосборки разбавьте раствор наночастиц в 100 раз в PBS в новой пробирке объемом 1,5 мл, чтобы получить конечный объем не менее 500 µL. Это обеспечит концентрацию наночастиц в диапазоне, подходящем для анализа трекинга наночастиц.

Затем загрузите образец в нано-канал. Убедитесь, что в систему не попали пузырьки воздуха; визуально проверьте, чтобы на экране было от 20 до 100 частиц. Идеальным количеством для трекинга наночастиц является примерно 50 частиц.

Если частиц слишком много или слишком мало, промойте NS 500, скорректируйте разведение в PBS и заново загрузите образец. Если количество частиц на экране составляет от 20 до 100, запишите видео. После записи видео перейдите к этапу обработки, открыв файл видео в этой же программе.

После открытия файла увеличьте усиление экрана. Выберите автоматическую настройку параметров изображения, отметив соответствующие поля. Если программное обеспечение распознает частицу на экране, она будет отмечена красным крестиком.

После того как все частицы будут отмечены, нажмите кнопку «process» в программном обеспечении, чтобы обработать видеофайл. Затем будут отображены размер частиц, средние значения распределения размеров и концентрация частиц, чтобы подтвердить точность подсчета частиц. Повторите эту процедуру, используя тот же образец, разведенный в два и четыре раза.

Клетки Forex в PBS были трансфицированы наночастицами E-G-F-P-P-B-A-E, как показано в данном видео. Для визуальной оценки эффективности трансфекции была проведена флуоресцентная микроскопия. На этих изображениях представлены флуоресцентные снимки, снимки в светлом поле и совмещенные изображения трансфицированных клеток; как видно на совмещенном изображении, большинство клеток экспрессируют EGFP и сохраняют нормальную морфологию.

Для количественной оценки эффективности трансфекции была проведена проточная цитофлуориметрия, результаты которой представлены на данном рисунке после выделения популяции живых клеток. В нерезецированной популяции EGFP-положительные клетки отсутствовали. Однако 71,6% обработанных клеток были положительны по EGFP. Затем был использован анализ трекинга наночастиц для определения распределения частиц по размеру и их концентрации.

Для данного анализа важно, чтобы распределение частиц по размерам было монодисперсным. Используя эти данные, можно рассчитать среднее количество плазмид на одну частицу, разделив концентрацию плазмид в растворе на концентрацию частиц, определенную с помощью NS 500. Количество плазмид на частицу представляет собой распределение, которое отражает распределение частиц по размерам.

В образце будут присутствовать как более крупные частицы, в которых количество плазмид на частицу превышает среднее значение, так и более мелкие частицы, в которых это значение ниже среднего. При выполнении данной процедуры важно помнить, что биодеградируемые полимеры нельзя слишком долго оставлять в водном растворителе перед добавлением наночастиц к клеткам; при использовании ncy отрегулируйте разведение в соответствии с требуемым размером частиц. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как трансфицировать адгезивные типы клеток с помощью невирусных полимеров для доставки генов, а также как измерять эффективность трансфекции и распределение частиц по размерам.

Не забывайте, что работа с клетками человека связана с биологической опасностью. При выполнении данной процедуры обязательно используйте средства индивидуальной защиты и работайте в боксе биологической безопасности.