Оценка Полимерные доставки генов наночастиц наночастиц Анализ отслеживания и высокой пропускной проточной цитометрии

Общая цель этой процедуры заключается в проведении и оценке экспериментов по доставке генов с использованием невирусных полимерных наночастиц. Это достигается путем предварительного пересечения клеток с частицами доставки генов. Эффективность трансфекции затем оценивается с помощью микроскопии и высокопроизводительного анализа проточной цитометрии.

Затем с помощью инструмента анализа отслеживания наночастиц определяются распределение наночастиц по размерам, концентрация и количество плазмид на частицу. В конечном счете, этот метод позволяет определить размер наночастиц и повысить эффективность трансфекции с использованием наночастиц. Основное преимущество использования биоразлагаемых полимерных наночастиц для доставки генов заключается в том, что они могут быть безопаснее и эффективнее, чем другие методы переноса генов.

Основное преимущество анализа отслеживания наночастиц по сравнению с существующими методами, такими как динамическое рассеяние света, заключается в том, что анализ отслеживания наночастиц напрямую дает среднее распределение чисел и концентрацию частиц. Этот метод поможет ответить на ключевые вопросы в области доставки невирусных генов, такие как количество плазмид на частицу, что важно для исследований коэкспрессии. Следующий протокол продемонстрирован с использованием эндотелиальных клеток сетчатки человека или hre в качестве модельных клеток и сложных эфиров полибета-аминоэфиров или PBA AEs в качестве модельных полимеров.

Обратите внимание, что условия культивирования и растворители могут потребовать корректировки в зависимости от используемых клеток и полимеров за 24 часа до этого. Трансфекция. Используйте многоканальную пипетку для посева семян в прозрачную культуру тканей, обработанную в плоском виде. Дно 96 луночных планшетов в концентрации от 25 до 50 клеток на микролитр.

Это обеспечит от 70 до 80% плавности в день трансфекции, подготовки и маркировки прозрачной обработанной культуры без тканей. 96 луночных планшетов будут служить в качестве мастер-пластин для приготовления и разбавления PBA и ДНК. Будут подготовлены две одинаковые тарелки.

Один для оценки токсичности и один для оценки эффективности трансфекции. Следуйте за поли-бета-аминоэфиром или полимером ПВАЭ и исходными растворами P-E-G-F-P-N 1D NA при комнатной температуре. После закваски с помощью 12-канальной пипетки приготовьте лунку, содержащую 50 микролитров 0,06 мг на миллилитр ДНК в 25 миллимолярном буфере из ацетата натрия для каждого состояния.

Далее на той же пластине разведите полимеры PBAE до 10 миллиграмм на миллилитр в буфере из ацетата натрия. Затем дополнительно разбавляют полимеры PBAE в полимерном массовом соотношении к массе ДНК 30 и 60 и 50 микролитров буфера ацетата натрия. Для образования наночастиц используйте 12-канальную пипетку, чтобы соединить 50 микролитров разбавленного ПБА с 50 микролитрами разбавленной плазменной ДНК, энергично перемешанной пипетированием вверх и вниз.

Затем дайте смеси понервироваться при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы дать возможность самостоятельной сборке. После самостоятельной сборки используйте 12-канальную пипетку, чтобы добавить по каплям 20 микролитров раствора наночастиц в каждую лунку засеянных клеток, содержащих среду, трансфектируют четыре лунки в каждом состоянии, как показано на этой схеме. Для каждой пластины зарезервируйте не менее четырех лунок для каждого отрицательного и положительного контроля.

Отрицательный контроль состоит из необработанных клеток и положительного контроля, состоит из клеток, трансфицированных коммерчески доступным реагентом, таким как lipo 2000 или Fuge hd. Инкубируйте планшеты с трансфицированными клетками при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов После инкубации используйте 12-канальную пипетку, чтобы удалить среду из клеток и заменить ее 100 микролитрами на лунку свежего зерна. Среды инкубируют еще от 24 до 48 часов.

На следующий день достаньте одну тарелку из инкубатора. Оцените трансфекцию клеток и токсичность с помощью флуоресцентной микроскопии, а также количественно оцените токсичность клеток с помощью водного анализа титра клеток 96, как описано в сопроводительном тексте. Через 48 часов достаньте вторую пластину из инкубатора.

Оцените эффективность трансфекции с помощью флуоресценции, микроскопии и проточной цитометрии, как описано в сопроводительном тексте. Используйте полученные здесь данные о токсичности и трансфекции, чтобы определить оптимальные концентрации ПБА для использования в будущих экспериментах. Наносайт NS 500 представляет собой прибор для анализа отслеживания наночастиц, который может предоставить информацию о распределении по размерам образца наночастиц путем отслеживания диффузии отдельных наночастиц перед использованием гидродинамической системы наносайта в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 миллилитра.

Подготовьте ПБА и ДНК плазмы для анализа, как и раньше, в тех же концентрациях, которые использовались в предыдущем разделе этого видео. После самостоятельной сборки разбавьте раствор наночастиц в 100 раз в PBS в новой пробирке объемом 1,5 миллилитра, чтобы получить конечный объем не менее 500 микролитров. Это позволит получить концентрацию наночастиц в подходящем диапазоне для анализа отслеживания наночастиц.

Далее загрузите образец в наносайт. Убедитесь, что не вводите пузырьки воздуха, визуально проверено, чтобы убедиться, что на экране от 20 до 100 частиц. Идеальное число для отслеживания наночастиц составляет примерно 50 частиц.

Если их слишком много или слишком мало, промойте NS 500, отрегулируйте разведение до PBS и повторно загрузите пробу. Если количество частиц на экране составляет от 20 до 100 видео. После того, как видео будут сняты, перейдите к этапу обработки, открыв видеофайл в том же программном обеспечении.

Затем, как только файл будет открыт, увеличьте усиление экрана. Выберите автоматическую настройку параметров изображения, нажав на соответствующие поля. Если частица на экране будет распознана программным обеспечением, она будет отмечена красным крестиком.

После того, как все частицы помечены, нажмите кнопку «Процесс» в программном обеспечении, чтобы обработать видеофайл. Затем будут отображены размер частиц, средние значения распределения и концентрация частиц, чтобы убедиться в точности подсчета частиц. Повторите эту процедуру, используя одну и ту же пробу, разбавленную в два х и четыре.

Форекс в PBS apre были трансфицированы наночастицами E-G-F-P-P-B-A-E, как показано в этом видео. Для визуальной оценки эффективности трансфекции была проведена флуоресцентная микроскопия. Эти изображения показывают флуоресцентное светлое поле и объединенные изображения трансфицированных клеток, как видно на объединенном изображении, большинство клеток экспрессируют EGFP и сохраняют нормальную морфологию.

Для количественной оценки эффективности трансфекции была проведена проточная цитометрия, как видно на этом рисунке, после гейтирования на живой популяции. Нерезецированная популяция не содержала EGFP-положительных клеток. Тем не менее, 71,6% обработанных клеток были положительными на наносайт EGFP. Затем для определения распределения и концентрации наночастиц был использован анализ отслеживания наночастиц.

Для этого анализа важно, чтобы распределение частиц по размерам было монодисперсным. Используя эту информацию, среднее количество плазмид на частицу можно рассчитать, разделив концентрацию плазмид в растворе на концентрацию частиц, определенную по NS 500. Количество плазмид на частицу — это распределение, которое отражает распределение частиц по размерам.

В образце будут содержаться более крупные частицы со значением плазмид на частицу выше среднего, а также более мелкие частицы со значением плазмид на частицу ниже среднего. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что не следует позволять разлагаемым полимерам оставаться в водном растворителе слишком долго, прежде чем добавлять наночастицы в клетки для использования ncy, регулировать разбавление, соответствующее размеру. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как трансфицировать типы клеток приверженности невирусными полимерами для доставки генов, а также измерить эффективность трансфекции, а также распределение частиц по размерам.

Не забывайте, что работа с клетками человека биологически опасна. Во время выполнения этой процедуры всегда надевайте средства индивидуальной защиты и работайте в шкафу биобезопасности.