Введение в работу с центрифугой

Центрифуга — это прибор, который используется практически в каждой биомедицинской исследовательской лаборатории по всему миру.

Центрифугирование представляет собой процесс, при котором центрифуга используется для разделения компонентов сложной смеси.

При вращении лабораторных образцов на очень высоких скоростях компоненты данной смеси подвергаются воздействию центробежной силы, что заставляет более плотные частицы перемещаться дальше от оси вращения, а более легкие — приближаться к ней. Эти частицы могут осаждаться на дне пробирки, образуя так называемый осадок (пеллет); этот изолированный образец или оставшийся раствор, супернатант, могут быть подвергнуты дальнейшей обработке или анализу.

Основным компонентом центрифуги является ротор — подвижная часть, которая вращается с высокой скоростью.

Роторы могут быть фиксированными, либо центрифуга может использовать несколько роторов, закрепленных на детали, называемой шпинделем.

Как правило, ротор центрифуги оснащен крышкой, которая плотно закручивается, чтобы предотвратить разлет образцов.

Многие центрифуги имеют блок охлаждения, который позволяет контролировать внутреннюю температуру во время центрифугирования.

Они также оснащены ручками или кнопками для ввода параметров каждого цикла, которые могут включать продолжительность вращения, температуру и величину центрифугирования в виде скорости или относительной силы.

Скорость вращения измеряется в RPM, или оборотах в минуту. RPM — это неоднозначный показатель, так как разделение частиц в смеси вызывает не сама скорость центрифуги, а сила, воздействующая на эти частицы.

Сила, воздействующая на частицу, зависит от радиуса ротора центрифуги, и поскольку разные центрифуги имеют роторы разного размера, при одной и той же скорости (RPM) могут воздействовать разные силы.

Интенсивность центрифугирования также может быть количественно определена как относительная центробежная сила, или RCF. RCF обычно представляется как кратная величина ускорения свободного падения Земли.

RCF выражается как произведение радиуса ротора на квадрат угловой скорости, деленное на ускорение свободного падения Земли.

RCF можно связать с RPM с помощью следующего уравнения, где r обозначает радиус центрифуги, измеренный в сантиметрах.

Использование этого уравнения может стать решающим фактором в успехе или неудаче эксперимента, однако вам не обязательно проводить этот расчет для каждой новой процедуры. Центрифуги часто комплектуются номограммами, которые помогают легко перевести RCF в RPM. Используйте линейку, чтобы соединить радиус центрифуги и заданное значение RPM для получения RCF.

Перед началом центрифугирования образцов обратите внимание на температуру. Если вы используете центрифугу с охлаждением, дождитесь, пока внутренняя температура прибора достигнет заданного значения, прежде чем запускать цикл, либо используйте другие способы охлаждения ротора.

Непосредственно перед запуском убедитесь, что все крышки пробирок плотно закрыты и надежно зафиксированы.

При загрузке пробирок следите за тем, чтобы каждый образец был сбалансирован другим образцом, расположенным строго напротив него.

Если у вас только одна пробирка, подготовьте еще одну пробирку, которая будет служить противовесом.

Если у вас три пробирки, расположите их в виде треугольника так, чтобы они находились на равном расстоянии друг от друга.

Соблюдение баланса масс в центрифуге имеет критическое значение. Роторы центрифуг развивают высокие скорости и обладают большой кинетической энергией. При неправильной балансировке весь блок центрифуги может сместиться с места установки, что приведет к серьезным повреждениям.

Убедившись, что ротор и крышка закреплены, запустите центрифугу и оставайтесь рядом, пока она не достигнет заданной скорости. Если вы заметили проблему, позовите опытного сотрудника лаборатории для оказания помощи.

По завершении центрифугирования биологический образец должен скопиться на дне пробирки в виде осадка (пеллета), отделившегося от остальной части раствора, или супернатанта.

Супернатант можно удалить путем декантации (простым сливанием) или путем аспирации (удаления с помощью вакуумного отсоса).

Затем очищенный образец можно снова перевести в раствор с помощью процесса, называемого ресуспендированием. Повторяющиеся циклы центрифугирования клеток с последующей аспирацией супернатанта и ресуспендированием в буфере часто называют промывкой клеток.

Теперь, когда вы ознакомились с основами центрифугирования, пришло время рассмотреть основные типы центрифуг и процедуры, которые с их помощью можно проводить.

Центрифуги с фиксированным углом ротора, вероятно, являются самым распространенным типом этого прибора, с которым вы столкнетесь в лаборатории. К этой категории относится множество настольных центрифуг.

Эти центрифуги, в которых пробирки расположены под фиксированным углом, используются в протоколах дифференциального центрифугирования. В таких протоколах серия циклов центрифугирования при различных скоростях может применяться для очистки биологических образцов, например, клеток животных. Как правило, такие протоколы включают несколько этапов промывки клеток.

В отличие от роторов с фиксированным углом, роторы с маятниковым механизмом имеют гибкие держатели для пробирок, что позволяет образцам отклоняться наружу. Такие роторы эффективны при центрифугировании в градиенте плотности, когда биологические образцы мигрируют в отдельные слои среды градиента. Этот тип центрифугирования полезен для быстрого отделения одного типа клеток от другого или для выделения отдельных органелл.

Наконец, ультрацентрифуга — это самый мощный прибор из всех центрифуг, которые можно встретить в лаборатории. Она способна вращаться со скоростью более 70,000 rpm, что делает ее отлично подходящей для выделения мелких частиц, таких как DNA или вирусы.

Из-за высоких скоростей работы этой центрифуги следует соблюдать особую осторожность, чтобы убедиться в правильной балансировке нагрузки, а также в надежной фиксации ротора и крышки.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по центрифугированию. В этом ролике мы рассмотрели: что представляет собой центрифуга и как она работает, как ею управлять и проводить центрифугирование, меры предосторожности, а также различные области применения этого метода. Спасибо за просмотр и не забывайте балансировать пробирки.