Использование Количественный ПЦР в реальном времени для определения Приживление клетки-донора в конкурентной мышиной модели трансплантации костного мозга костей

Общая цель данной процедуры заключается в проведении метода на основе ПЦР для количественного определения приживления донорских клеток в конкурентной модели трансплантации костного мозга мышей. Для этого сначала выполняется трансплантация костного мозга самкам мышей-реципиентов с использованием клеток доноров-самцов. Затем у мышей-реципиентов в разные временные точки собирают периферическую кровь и выделяют геномную ДНК. Образцы подготавливают для построения стандартной кривой.

Наконец, проводится ПЦР в реальном времени со стандартными и исследуемыми образцами. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие приживление клеток мужского донора у мышей-реципиентов женского пола, путем расчета по стандартной кривой с известным процентным соотношением мужской и женской ДНК. Основное преимущество данного метода перед существующими, такими как метод на основе проточной цитометрии, заключается в его более высокой чувствительности, экономичности и возможности длительного хранения образцов.

Что наиболее важно, наш метод практически не зависит от генетического состава и может быть использован для любого геномного фона мышей, например, при наличии четко определенных маркеров поверхности клеток для дифференциации донорских клеток от реципиентных. После эвтаназии самцов-доноров и самок мышей линии FVB nj под ламинарным потоком воздуха с помощью маленьких ножниц и пинцета извлеките бедренную и большеберцовую кости и поместите их в чашку для культивирования тканей диаметром 60 мм, содержащую 6 мл ледяного RPMI 1640 с 5% термоинактивированной FBS. Используйте салфетку Kim wipe для удаления мышц и других тканей, а затем отсеките оба конца каждой диафизарной части кости непосредственно в чашке. Затем подсоедините конец кости к игле калибра 23G, закрепленной на шприце объемом 3 cc, заполненном RPMI 1640 с 5% термоинактивированной FBS, и вымойте костный мозг.

Используйте ту же иглу для дезагрегации ткани костного мозга путем многократных аспираций. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение пяти минут при 400 G. После удаления супернатанта ресуспендируйте клетки в одном миллилитре буфера для лизиса эритроцитов комнатной температуры и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут, после чего добавьте от 5 до 10 мл среды RPMI 1640 с 5% heat inactivated FBS; пропустите клетки через клеточный фильтр и соберите фильтрат в новую пробирку. После центрифугирования клеток в течение пяти минут при 400 G и удаления супернатанта осадок не должен иметь красного цвета, что указывает на полное удаление эритроцитов; ресуспендируйте осадок в 10 мл среды RPMI 1640 с 5% heat inactivated FBS, после осторожного перемешивания на вортексе перенесите небольшую аликвоту в гемоцитометр и подсчитайте количество клеток.

Рассчитайте объем клеток, необходимых для смешивания с конкурирующими женскими клетками в соотношении пять к двум для трансплантации костного мозга. В качестве заключительного этапа подготовки клеток к инъекции смешайте донорские и конкурирующие клетки, осадите их центрифугированием, промойте PBS и ресуспендируйте в PBS до конечной концентрации 5×10⁶/мл для донорских клеток и 2×10⁶/мл для конкурирующих клеток за четыре-шесть часов до трансплантации костного мозга. Облучите мышей-реципиентов женского пола гамма-излучением цезия 137 в однократной дозе 11 Гр.

Поместите облученные мыши женского пола в фиксаторы и введите смесь донорских и конкурентных клеток в хвостовую вену в общем объеме 0,1 миллилитра так, чтобы каждая мышь получила 5 × 10⁵ донорских клеток и 2 × 10⁵ клеток костного мозга конкурента для последующего забора проб крови. После проведения анестезии соберите около 50 µL крови в пробирки с EDTA путем ретроорбитального кровопускания. Также соберите образцы от самцов и самок мышей соответствующего возраста.

Далее изолируют геномную ДНК из образцов мышей. Для построения стандартной кривой к каждому образцу крови добавляют около 200 µL буфера для лизиса эритроцитов комнатной температуры и инкубируют в течение пяти минут. Добавляют 1 mL PBS и центрифугируют для удаления основной массы лизированных эритроцитов.

Затем с помощью набора для экстракции ДНК из крови изолируйте ДНК, предварительно нагрев элюирующий буфер до 37 °C. Для повышения выхода измерьте концентрацию ДНК в каждом образце. Для дальнейшего анализа используются образцы с соотношением OD 260/280 от 1,8 до 2,0.

Для построения стандартной кривой разведите ДНК самцов и самок до концентрации 4 нг/мкл и подготовьте смесь ДНК согласно данным указаниям. Подготовьте планшет для ПЦР-реакции, смешав реагент Cyber Green Super Mix с праймерами, указанными здесь, и геномной ДНК. Каждая реакция в объеме 20 мкл содержит 400 нМ каждого праймера и 5 мкл геномной ДНК клеток крови; анализ проводится в трех повторностях.

Проведите ПЦР в соответствии с условиями, указанными в текстовом протоколе, и получите значения порогового цикла или CT. Рассчитайте delta CT, умноженное на количество CT в степени ZY 1 минус CT в степени BCL 2, и уровни экспрессии ZY 1 или 2 в степени минус delta CT; постройте стандартные кривые, нанеся средние значения двух в степени delta CT из трех повторностей в зависимости от известного процента мужской ДНК в смеси с отображением линейной регрессии. Ниже приведены примеры стандартных кривых, построенных по средним значениям двух в степени delta CT в зависимости от процентного содержания мужской ДНК.

На данном графике указаны специфические температуры плавления для ампликонов BCL2 и ZFY1, которые составляют 78.5 и 88.5 °C соответственно. BCL2 используется в качестве референсного гена для нормализации общего количества ДНК, внесенного в каждую ПЦР-реакцию. Кривые амплификации BCL2 для каждого стандартного образца совпадают независимо от концентрации мужской ДНК, что свидетельствует о равном количестве внесенной ДНК.

Однако кривые амплификации ZFY смещались влево по мере увеличения количества мужской ДНК в образцах гемопоэтических стволовых клеток мышей PIM TKO; данные клетки имеют дефекты при восстановлении летально облученных мышей, и, как и ожидалось, у мышей-реципиентов, которым пересаживали клетки PIM TKO, процент мужских клеток был значительно ниже по сравнению с мышами, получившими клетки дикого типа. Для подтверждения нашего метода мы протестировали приживление мужских донорских клеток в пересаженных самках мышей, получавших клетки костного мозга мышей дикого типа или мышей с тройным нокаутом PIM (TKO) в разные временные точки после трансплантации: образцы периферической крови через шесть недель и образцы костного мозга через 16 недель. Анализ проводился после просмотра этого видео.

Вы должны иметь хорошее представление о том, как использовать метод ПЦР для количественной оценки приживления донорских клеток в конкурентной модели трансплантации костного мозга морских организмов.