Введение в твердом носителе мембранный электрофизиологии

Таким образом, мембранная электрофизиология была сокращена до электрофизиологии на основе SSM. Это новый электрофизиологический подход. Для ряда применений он предлагает значительное улучшение по сравнению с традиционными методами.

Основным инструментом традиционной электрофизиологии является электрод, наполненный микрочастицами, в то время как электрофизиология на основе М обнаруживает транслокацию заряда через мембранный электрод с твердой опорой. Это чрезвычайно полезно в тех случаях, когда традиционная электрофизиология не может быть использована, например, в случае бактериальных транспортеров, которые, за редким исключением, не могут быть исследованы с помощью клещей напряжения или коммутационных кулачковых методов. В таких случаях электрофизиология на основе SSM оказалась очень успешной.

Он также может быть использован для исследования физиологически значимых эукариотических транспортеров во внутриклеточных мембранах. Существует множество способов проведения электрофизиологических экспериментов на основе SSM. В фундаментальных исследованиях он может быть применен для определения кинетических параметров и уточнения механизма транспортировки, но его надежность и потенциал автоматизации делают его идеальным для применения в приложениях скрининга при обнаружении следов.

Электрод SSM несет сложную мембранную систему, состоящую из нижележащего SSM и заимствованных протеасом, или фрагментов мембраны, содержащих интересующий вас транспортный белок. Электрические свойства составной мембраны могут быть описаны эквивалентной схемой, в которой мембраны образуют емкостно-связанную систему. Обратите внимание, что электрические свойства системы по существу одинаковы независимо от того, используются ли фрагменты мембраны или липосомы протеи.

Смещение заряда в транспортном белке передается в измерительную цепь через емкость мембраны мочевого пузыря. Принцип детектирования называется емкостной связью. В типичном эксперименте быстрый обмен раствором в VSSM обеспечивает субстрат для транспортного белка V. Последующая электрогенная транспортная активность белка генерирует ток, который связан с измерительной системой через емкость SSM.

В то же время, электрогенная активность белка постепенно заряжает липосомальную мембрану, что приводит к ингибированию транспортного белка и снижению тока в регистрирующей цепи, измеренный ток является результатом одновременных реакций транспортировки миллионов липосом, поглощенных Энцо. Каждый содержит около 100 транспортеров. Установка состоит из клетки Фарадея с каналом раствора, внешних цепей для управления клапанами, усиления сигнала, а также сбора и анализа данных.

Клетка EC включает в себя контейнеры, клапаны и трубки, необходимые для управления потоком раствора, а также локоть с чипом XOR. Чип XOR содержит электрод SSM и поглощенные липосомы прота. Вете подключается к усилителю и генератору функций внешней электрической цепи.

Измерения SSM, возгорание, два раствора, один активирующий, а другой неактивирующийся, отдельно от подложки, которая присутствует только в активирующем растворе. Оба решения имеют одинаковый состав в конфигурации с одной биржей. Два двухходовых клапана управляют потоком неактивирующего и активирующего растворов.

Терминальный клапан, механически соединенный трехходовой клапан, используется для переключения между неактивирующим и активирующим растворами, направляя один из растворов в контейнер для отходов, а другой раствор в QVE. При переключении клеммного клапана поток неактивирующего раствора перенаправляется к сливу, а активирующий раствор течет к QVE. Такая конфигурация обеспечивает одновременный непрерывный поток обоих решений.

В любой момент в рамках протокола расхода траектория потока может быть оптимизирована в соответствии с потребностями. Однако следует помнить, что расстояние между SSM и соединением неактивирующего и активирующего решений должно быть как можно меньше. Так как он определяет таймер решения биржи.

Усилитель тока за пределами каркаса силовой деки подключен к чипу датчика. Как правило, это установлено на усиление 10 в степени от восьми до 10, на мощность девять вольт на ампер и время отдыха от одного до 10 миллисекунд. Функциональный генератор подключен к электроду сравнения, а компьютер с программным обеспечением для управления клапанами и сбора данных, а также интерфейсный блок завершают систему.

В интерфейсном блоке размещены приводы клапанов, сбор данных и цифровой выход аппаратного решения, поток которого поддерживается сжатым воздухом ох 0,22. Давление в одном баре контролируется с помощью цифрового миллиметра. Его можно обслуживать, заполняя стальной контейнер, установленный между подачей воздуха и контейнерами с раствором в EC Cage, с помощью игольчатого клапана.

CVIC состоит из четырех частей. Дзен-чип зажат между ветеринарной базой и ветеринарной головой. Цилиндрический выходной соединитель прикручивается к ветеринарной головке и несет электрод сравнения в сборе.

Электрод сравнения состоит из хлорированной серебряной проволоки с миниатюрным разъемом SMC и изолирован от проточного пути соляным мостом из полиакрилового геля. Неиспользуемый гелевый мостик хранится в 100 миллимолярном растворе фосфата калия pH 7, содержащем 100 миллимоляров хлорида калия. Во-первых, электрод сравнения должен быть установлен в блок электрода сравнения, содержащий геомост.

Важно избегать образования пузырьков воздуха при установке электрода сравнения. Теперь эта часть веты прикреплена к выходному разъему, который был предварительно заполнен буферным раствором. Все соединения должны быть герметизированы уплотнительными кольцами.

Этот SM формируется на чипе zor, структурированном стеклянном светильнике с козьим покрытием. Эта сематическая дорога имеет диаметр один миллиметр и соединена с контактной площадкой через белую контактную полосу толщиной 0,2 миллиметра. Контакт пружины создает контакт с усилителем.

Чип дзен хранится в темноте в растворе тиолэтанола Okta Deccan мощностью 10 лари. Чтобы сохранить его магический слой и удалить вирусные молекулы Okta deccan, которые не были абсорбированы, электрод промывают чистым этанолом, а электрод сушат в газообразном азоте. Теперь монослой фосфохолина может быть собран.

Липидный раствор содержит 15 миллиграмм на миллилитр холина DFI и 250 микрограмм на миллилитр. Окта два А мина находится в состоянии разложения и хранится при температуре минус 20 градусов. Теперь электрод точно расположен на основании SA локтя.

Один микролитр раствора добавляется в электрод SSM, не касаясь золотого слоя. Сразу после добавления липидного раствора вете можно собирать. Объем vete, герметизированный уплотнительным кольцом, имеет цилиндрическую форму с внутренним объемом 17 микролитров при монтаже.

SSM должен располагаться по центру под входным отверстием. Перед подключением к ветеринарному врачу жидкостная система должна быть предварительно заполнена 100 миллимолярным буферным раствором фосфата калия. Важно следить за тем, чтобы в трубках и клапанах не было пузырьков воздуха.

Теперь ветеринарный врач может быть установлен в дневную клетку для щитовидной железы, подключить усилитель, вход и выход канала потока раствора и генератор функций. Наконец, локоть можно промыть 100-миллиметровым буфером фосфата калия. Это приводит к спонтанному образованию SSM для проверки качества SSM.

Емкость и проводимость измеряются с помощью функционального генератора, для измерения проводимости используется напряжение постоянного тока 100 милливольт. Затухание тока показывает зарядку мембранного конденсатора после того, как конденсатор полностью заряжен. Измеренный ток дает проводимость мембраны с использованием закона M'S.

Здесь мы наблюдаем проводимость oh 0,17 наноСименс. Емкость можно измерить с помощью треугольного переменного напряжения переменного тока с амплитудой от пика до пика 50 милливольт и частотой он 0,5 герц. Амплитуда результирующего прямоугольного волнового тока представляет собой сужающий ток конденсатора.

Емкость равна передаваемому заряду, деленному на приложенное напряжение. Эта мембрана показывает емкость 2,3 нано, высокая проводимость и низкая емкость указывают на то, что SSM формируется неправильно. В этих случаях мембрану следует отбросить и приготовить еще одну ССМ с использованием нового электродного чипа.

Обычно липосомы прота хранятся в замороженном виде при температуре минус 80. TRE th образца на ультразвуковой обработке льда имеет важное значение, поскольку агрегированный образец поглощает шкив к SSM с получением однородной суспензии прот-липосом. Три десятисекундных цикла ультразвуковой обработки чередуются с десятисекундными интервалами охлаждения на льду.

Промойте их SSM неактивирующим раствором. Затем открутите выходной разъем вместе с образцом электрода сравнения. С помощью пипетки введите 30 микролитров образца белка через выходное отверстие вете в объем этте.

Сначала установите наконечник пипетки на выходное отверстие. Затем откройте инструкцию выше в неактивирующем пути и введите липосомы протеи. Перед тем как понизить кончик пипетки.

Закройте приведенное выше руководство, чтобы предотвратить дальнейшее вытекание раствора. Дайте липосомам протеи впитаться в SSM в течение инкубационного времени от одного до двух часов. Используйте окно протокола расхода программного обеспечения для управления клапанами и сбора данных для определения протокола расхода.

Если вы хотите проводить измерения в симметричных условиях, например, для определения специфичности субстрата, значения KM или зависимости pH, выберите протокол обмена одного раствора. Установите продолжительность потока для каждого раствора от от 0,5 до одной секунды. Ток записывается по всему протоколу потока.

Усиление обычно устанавливается на 10 в степени девяти, а для частоты дискретизации мы выбираем 2000 точек данных в секунду. Наконец, сохраните свой новый протокол под заголовками NA a и a. Во втором нажатии окна протокола расхода вы можете определить открытое или закрытое состояние определенных клапанов для управления потоком неактивирующего или активирующего раствора через кубит

Здесь мы демонстрируем измерение липосом, импорта сахарных протонов, таких как Y из кишечной палочки. Активирующий раствор содержит транспортируемый субстрат лактозу, в то время как неактивирующий раствор содержит такое же количество нетранспортируемой глюкозы, как и компенсаторное соединение. В дополнение к сахарам, растворы содержат 100 миллимолярных фосфатов калия при pH 7,6 и один миллимолярный DTT.

После смены раствора используйте ручной клапан, чтобы убедиться, что пузырьки воздуха удалены. Перед началом протокола расхода отрегулируйте давление непосредственно перед началом измерения. Обычно мы используем давление Ø 0,6 бар, что при нашей конкретной конфигурации клапанов и трубок дает расход около одного миллилитра в секунду.

Затем выберите здесь протокол безопасного расхода, протокол NAA, и нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать каждое измерение. Во время первых нескольких измерений слабо абсорбированные, липосомы протеи удаляются, и поэтому пиковый ток может уменьшиться. Повторяйте измерение до тех пор, пока пиковый ток не останется постоянным.

Во время первой фазы потока неактивирующего раствора ток равен нулю. Переход от неактивирующего к активирующему раствору, содержащему лактозу, индуцирует электрогенную транспортную активность мембраны. Положительный заряд белка накапливается внутри липосом, и усилитель обнаруживает положительный переходный ток из-за положительной связи через SSM.

Этот положительный положительно связанный ток называется включенным в сигнал V обменом от активирующего раствора. Обратно к неактивирующему раствору индуцируется транспорт кода протонного сахара из липосом. В этом случае при отрицательном токе с LY связью отображается так называемый сигнал выключения для кинетического анализа белка.

Используется только сигнал включения, так как сигнал выключения плохо определен из-за состояния заряда мембранного клапана, переключение создает механические и электрические артефакты. К счастью, они ограничены временным диапазоном до того, как будут наблюдаться сигналы, индуцированные белком. Обратите внимание, что задержка в 50 миллисекунд между артефактами переключения клапана и сигналами транспортера — это время, необходимое раствору для распространения от терминального клапана до поверхности модуля быстрого обмена растворами SSM. Например, выполненный на SSM, представляет собой типичный эксперимент по релаксации.

В таких экспериментах ток ослабевает через зависящую от времени предустановившуюся фазу в постоянное устойчивое состояние. Текущие кинетические детали реакционного цикла могут быть получены из формы и величины предустановившегося тока. В то время как установившийся ток предоставляет информацию о непрерывном обороте мембранного белка.

В ly-связанной системе, где липосомы протеи поглощаются до уровня SSM, предустановившиеся токи практически не изменяются. В то время как постоянный устойчивый ток никогда не достигается, вместо этого из-за зарядки липосом, измеряемый ток постепенно уменьшается. Транспортный ток может быть рассчитан по измеренному току с высокой связью с помощью анализа цепи.

Здесь мы демонстрируем репрезентативные результаты с использованием сахарного протонного котранспортера, такого как Y, в диапазоне PA от 8,5 до 7,6. В токе переносчика преобладает электрогенная реакция на поздних этапах цикла реакции. В этих условиях поверхность в предустановившемся состоянии состоит из простого повышения тока до значения установившегося состояния.

Затем он затухает из-за емкостной связи. Нас интересует стационарный транспортный ток. При отсутствии мембранного потенциала он представлен в хорошем приближении пиковым током.

Таким образом, кинетику Али-Мейна можно проанализировать путем блоттинга пиковых токов для различных концентраций субстрата, но учтите, что пиковые амплитуды токов могут быть строго сравнены только в том случае, если они получены с помощью одного датчика в одном эксперименте. Одной из причин является изменчивость эффективности поглощения. Когда pH еще больше снижается, монофазный сигнал становится двухфазным.

И, наконец, быстрым переходным процессом остается для транспорта дефицитный лаг мутанта Y. За быстрым переходным процессом следует небольшая, более медленная отрицательная составляющая. Отрицательная составляющая характерна для быстрых переходных токов, измеряемых в ly-связанных системах, и вызвана мембранным емкостным разрядом.

В данном случае пиковый ток представляет собой не устойчивый транспорт, а скорее электрогенное подтверждение перехода в начале ионного цикла, что становится очевидным, потому что a la y мутант не проявляет устойчивого транспорта, а для запаздывания дикого типа, устойчивый транспорт y подавляется низким pH. Экспериментальные данные позволяют получить механистическую интерпретацию переноса заряда в реакционном цикле лага y, что показано в кинетической модели. Быстрый переходный процесс, наблюдаемый для мутантного мутанта с недостаточным транспортом, или в случае запаздывания Y дикого типа в кислых условиях, обусловлен быстрой еженедельной электрогенной реакцией после связывания лактозы при более высоких значениях pH, в сигнале доминирует основная электрогенная реакция на поздних этапах реакционного цикла, которая, как предполагается, представляет собой псевдоплазматический выброс протонов в емкостно-связанной системе.

Это приводит к переходным токам, представляющим собой установившийся перенос Lag y из-за сильного взаимодействия Utes. С помощью SSM электрические артефакты генерируются при обмене растворами различного состава. Убедитесь, что неактивирующие и активирующие растворы максимально похожи, особенно в отношении их pH и ионной силы.

Контроль должен быть проведен, потому что подложки также могут образовывать артефакты. Всегда проверяйте свою конкретную буферную систему и протокол потока на артефакты с использованием чистого SSM перед добавлением образца белка. После добавления белка в пробу можно проводить контрольные измерения с растворами, содержащими несубстраты, которые структурно сходны с субстратом.

Кроме того, есть возможность протестировать субстрат на артефакты с помощью липосом или фрагментов мембраны без интересующего белка. Вы также можете добавлять ингибиторы в растворы или пипетировать их. После проведения эксперимента непосредственно на выходе из веты для измерения ингибирования сигнала транспортера, специфические для белка сигналы исчезают, оставляя только артефакты обмена растворами.

В этом случае сигнал белка можно легко скорректировать. Убедитесь, что потеря абсорбированного прота, липосом или деградация белка не повлияют на результаты измерений. При выполнении повторных контрольных измерений в идентичных условиях допустимым является утечение сигнала до 20%, которое может быть скорректировано путем предположения о линейной зависимости сбоя от времени.

Эта установка является результатом 20 лет технических разработок в нашей лаборатории. Кроме того, доступны специализированные системы с более быстрым таймером для кинетического анализа и меньшим расходом раствора для дорогих подложек. Для скрининга лекарств мы используем полностью автоматические установки с более высокой пропускной способностью.

На сегодняшний день с помощью данного метода было охарактеризовано более 20 транспортеров. К ним относятся транспортные АФА, комплексы дыхательной цепи, холодные транспортеры, обменники и даже железные каналы. Поэтому, когда вы не можете решить свою проблему с помощью стандартной электрофизиологии, рассмотрите возможность использования электрофизиологии SS Mase.