Данио рерио модели сахарного диабета и метаболических памяти

Метаболическая память явления, которые диабетических осложнений сохраняться и развиваться беспрепятственно, даже после euglycemia достигается фармацевтически. Здесь мы опишем сахарного диабета у рыбок данио модель, которая уникальна тем, что она позволяет рассмотрении митотически передаваться эпигенетические компонентов метаболического памяти

Общая цель этой процедуры заключается в создании модели сахарного диабета первого типа у рыбок данио-рерио, которая может быть использована для обнаружения молекулярной основы осложнений сахарного диабета и, что более важно, определения генетической основы их персистенции. Это достигается путем предварительного индуцирования гипергликемии с помощью серии инъекций диабетогенного препарата STZ и инкубации рыбы при пониженной температуре. Затем, через три недели, определяется уровень глюкозы в крови натощак, чтобы убедиться, что гипергликемическое состояние было индуцировано, и прием препарата прекращается, чтобы инициировать восстановление бета-клеток.

Затем плавник кауделя ампутируют и дают ему регенерировать, чтобы изолировать генетически передаваемые компоненты метаболической памяти и удалить потенциально осложняющие факторы предыдущей гипергликемической среды. Наконец, проводится анализ регенерации плавников для документирования стойкого снижения регенерации плавников и выявления индуцированных изменений в разрезанной ткани с помощью интересующего анализа. Основное преимущество модели рыбок данио-рерио при диабете по сравнению с существующими заключается в том, что метаболическая память может быть изучена в условиях истинного гликемического индекса U летом, что и то, что наблюдалось бы у пациентов после трансплантации поджелудочной железы.

Мы ожидаем, что модель будет использована для открытия эпигенетических модификаций, лежащих в основе метаболической памяти и стойкости диабетических осложнений. Чтобы получить рыбок данио с сахарным диабетом, подготовьте восстановительный резервуар с нормальной рыбьей водой и анестезирующий резервуар с рыбьей водой в разведении 1 к 1000 двух феноксиэтанолов под вытяжным шкафом. Приготовьте 0,3%-ный раствор СТРЕПТОЗОТОЦИНА или СТЗ, добавив шесть миллиграммов СТЗ к двум миллилитрам 0,09%-ного натрия хлорида, и сразу же поместите раствор на лед в отдельную пробирку. Аликвоты достаточно физраствора для контроля.

Рыба заполняет шприц половиной CC, оснащенный иглой 27 с половиной калибра, STZ или контрольными растворами, гарантируя, что пузырьки воздуха не задерживаются. Обезболите одну рыбу, поместив ее в обезболивающую воду и дождавшись, пока плавательное движение прекратится примерно на одну-две минуты. После кратковременной анестезии поместите рыбу на бумажное полотенце, чтобы она впитала лишнюю воду, затем поместите рыбу в лодку и взвесьте ее.

Далее поместите рыбу на твердую поверхность. Затем введите иглу за скос в заднюю часть вентральной брюшины и введите либо 0,35 мг на грамм TZ, либо эквивалентный объем контрольного раствора в брюшную полость рыбы после инъекции. Поместите рыб в резервуар для восстановительной воды и следите за его нормальной плавательной активностью.

После введения достаточного количества рыб для эксперимента пересадите их в обычные жилые резервуары и поддерживайте температуру от 22 до 24 градусов по Цельсию. Пониженная температура имеет решающее значение для эффективной индукции гипергликемии, чтобы вызвать длительное состояние очень высокой гипергликемии, следовать графику частых инъекций во время фазы индукции, за которыми следуют еженедельные поддерживающие инъекции, как показано здесь, для сбора крови. Для определения FBGL подготовьте маркированную ПЦР-пробирку для каждого образца крови, содержащую пять микролитров нормального физиологического раствора.

После обезболивания рыбы промокните лишнюю воду, поместите рыбу на предметное стекло микроскопа и с помощью скальпеля удалите голову у основания оперкулома, соберите кровь, которая выделяется на предметном стекле и быстро добавьте ее в ПЦР-пробирку стерильного, нормального физиологического дозирования, пипетируя вверх и вниз, чтобы убедиться, что кровь не свернется, сразу поместите образец на лед. Определите объем образца крови, измерив общий объем жидкости в пробирке и вычитая пять микролитров физиологического раствора. Перелейте пять микролитров разбавленной крови из каждой ПЦР-пробирки в микропробирку объемом 1,5 миллилитра и используйте набор для анализа глюкозы квантового хрома в соответствии с инструкциями производителя для определения концентрации глюкозы в крови.

После обезболивания рыбы поместите ее в чашку Петри и под препарирующий эндоскоп с помощью стерильного скальпеля размера 10 ампутируйте плавник няшки, разрезав прямую линию, проксимальную к первой точке ветвления липидной трахеи для фазы регенеративного роста анализа. Поместите рыбу в резервуар для восстановления при температуре 33 градуса Цельсия, чтобы изобразить регенерирующие плавники. После обезболивания рыбы расправьте плавник так, чтобы он полностью выпрямился, и используйте препарирующий эндоскоп, оснащенный камерой и программным обеспечением NIS element.

Собирайте изображения с одним кратным увеличением для измерения регенеративного роста. Распечатайте изображения и используйте программное обеспечение image J и блокнот для рисования для трассировки вокруг всей области нового роста для точной трассировки. Убедитесь, что нет теней или капель воды, и сделайте каждое измерение пять раз, чтобы рассчитать среднее значение.

Чтобы нормализовать измерения, измерьте длину места ампутации по дорсальной вентральной оси и разделите ранее определенную площадь по этому измерению. После создания группы DM FISH и их контроля через 21 день определите FBGL для подмножества группы и разделите DM fish на две подгруппы на время эксперимента. Продолжайте еженедельные инъекции STZ для одной из групп в то время, как контроль DM для второй группы, прекратите инъекции STZ и инкубируйте рыбу при нормальной температуре.

В течение 14 дней эти рыбки данио восстанавливают нормальный уровень инсулина и глюкозы в крови за счет регенерации поджелудочной железы. Эти рыбы теперь называются метаболической памятью или ММ, у рыб на 30-й день после удаления препарата ампутируют плавники косоклюшника контрольной СД и ММ, как было показано ранее в этом видео, чтобы обеспечить рост ткани метаболической памяти. Верните рыб в нормальные водные условия для регенерации плавников на 30 дней на 60 день.

Выполнить повторную ампутацию в пределах ткани, которая была регенерирована в период от 30 до 60 дней, и провести анализ регенерации плавников, изолировать ткань и провести интересующий анализ. У рыбок данио рерио первого типа не только наблюдаются известные вторичные осложнения ретинопатии и нефропатии, но и наблюдается дополнительное осложнение в виде нарушения регенерации плавников, что можно увидеть здесь через 72 часа после ампутации. Это осложнение сохраняется из-за метаболической памяти у рыб, которые восстановили нормальный контроль глюкозы после гипергликемического периода, как показано здесь, у рыб зебры наблюдается дефицит регенерации плавников примерно на 40% по сравнению с контрольной рыбой, и это нарушение наблюдалось уже через 150 дней после ампутации.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как инициировать гипергликемическое состояние у рыбок данио, измерять уровень глюкозы в крови натощак, проводить исследования регенерации плавников и, в конечном итоге, генерировать метаболическую память у рыб.