Выделение предсердия человека Миоциты для одновременных измерений Ca 2 + Переходные и мембранные токи

Общая цель этой процедуры заключается в выделении миоцитов предсердий человека, пригодных для одновременного измерения кальция, переходных процессов и мембранных токов. Образец правого предсердия получают от пациентов, перенесших операцию на открытом сердце, и быстро транспортируют для начала процедуры. Первым этапом процедуры является очистка ткани и разрезание ее на небольшие кусочки ткани.

Вторым этапом является двукратное ферментативное расщепление ткани протеолитическими ферментами, в результате чего образуются изолированные миоциты предсердий. Заключительный этап включает в себя загрузку миоцитов кальциевым чувствительным флуоресцентным красителем. В конечном счете, совместное использование эпифлуоресцентной микроскопии и метода патч-зажима позволяет одновременно регистрировать переходные процессы кальция с мембранными токами или потенциалами действия.

Этот метод может помочь понять молекулярную основу клеточных аномалий обработки кальция, лежащих в основе сердечных заболеваний, таких как фибрилляция предсердий, демонстрируя метод Клаудия Лира, старший техник нашей лаборатории, Ткань предсердий человека, полученная от пациентов, перенесших операцию на открытом сердце по поводу коронарного шунтирования или замены митрального клапана, должна быть быстро транспортирована в лабораторию в транспортном растворе. Оказавшись в лаборатории, перенесите образец ткани и раствор в 10-сантиметровую чашку. Затем примерно удалите жировую клетчатку с помощью ножниц.

Далее помашите образцом ткани. Храните от 200 до 600 миллиграммов для изоляции клеток, а оставшуюся часть заморозьте в жидком азоте для биохимического анализа. Переложите ткань для изоляции клеток в чашку с прохладным раствором без кальция и разрежьте ткань на кусочки размером в один кубический миллиметр, чтобы промыть ткань.

Переложите его вместе с раствором без кальция в стакан с оболочкой. Нагревается до 37 градусов. Подавайте кислород через линию, закрытую наконечником для дозатора, чтобы предотвратить сильное образование пузырей.

Осторожно помешивайте салфетку в течение примерно трех минут с помощью магнитной мешалки. Затем дайте ткани осесть. Теперь осторожно процедите надосадочную жидкость через нейлоновую сетку толщиной 200 мкм.

Большая часть ткани должна остаться в стакане. Наполните стакан подогретым до 37 градусов раствором без кальция. Затем верните натянутые куски ткани из сетки в стакан с помощью щипцов и повторите процедуру промывки дважды.

Начните эту часть процедуры с приготовления 20 миллилитров подогретого до 37 градусов Цельсия раствора фермента Е, содержащего коллагеназу и протеазу. Тщательно процедите раствор без кальция после заключительного этапа промывки и повторно суспендируйте промытую салфетку в растворе E one. Верните собранную на сетку ткань в стакан.

Тщательно перемешивайте суспензию в течение 10 минут. Затем добавьте 40 микролитров 10 миллимолярного хлорида кальция и продолжайте помешивать в течение 35 минут. Далее осторожно процедите надосадочную жидкость через капроновую сетку.

Большая часть ткани должна остаться в стакане. Приготовьте 20 миллилитров ферментного раствора Е два, содержащего только одну коллагеназу, и используйте его для заправки стакана. Верните собранную на сетку ткань в стакан.

Затем сразу же добавьте 40 микролитров 10 миллимолярного раствора хлорида кальция во время второго пищеварения, изредка используйте ножницы для измельчения сгустков тканей. Через пять минут возьмите пробу суспензии, чтобы проверить диссоциацию клеток под микроскопом. Продолжайте брать образцы каждые две-три минуты, пока не станут хорошо видны палочковидные поперечно-полосатые кардиомиоциты.

Затем прекратите помешивание, дав ткани осесть. После отстаивания осторожно процеживаем надосадочную жидкость через капроновую сетку и помещаем в пластиковую трубку объемом 50 миллилитров. Далее суспензируйте ткань в 20 миллилитрах раствора для хранения и верните натянутые куски ткани из сетки в стакан.

Далее диссоциируйте клетки с помощью щадящей механической обработки. С помощью пипетки объемом 20 миллилитров старайтесь избегать образования пузырьков. Далее осторожно процедите надосадочную жидкость через нейлоновую сетку после процеживания центрифуги, обе надосадочные жидкости собирают при 90 5G в течение 10 минут.

Чтобы гранулировать клетки, отбрасывайте надосадочную жидкость путем аспирации, не нарушая резонатор гранул. Суспензируйте каждую гранулу в 1,5 миллилитрах хранительного раствора при комнатной температуре. Далее добавьте в каждую пробирку по 7,5 микролитров 10 миллимолярного раствора хлорида кальция и подождите 10 минут.

Затем добавьте еще 7,5 микролитров хлорида кальция, и подождите еще 10 минут. После ожидания добавьте в треть 15 микролитров объема 10 миллимоляров хлорида кальция, чтобы довести конечную концентрацию хлорида кальция в растворе до 0,2 миллимоляра. Целью такой изоляции является получение клеток, пригодных для внутриклеточного измерения кальция.

Таким образом, крайне важным требованием является исключение любых буферов кальция, таких как EGA, из буферного раствора. Перелейте 1,5 миллилитра клеточной суспензии в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку. Следующие шаги должны быть выполнены с учетом светочувствительности флуоресцентного индикатора кальция.

Грипп О три. Во-первых, приготовьте один миллимолярный раствор для гриппа в 3:00 утра. Этот раствор может храниться при температуре минус 20 градусов Цельсия до одной недели.

Далее добавьте 15 микролитров исходного раствора гриппа или 3:00 AM в 1,5 миллилитра клеточной суспензии. Тщательно перемешайте смесь и выдержите суспензию в течение 10 минут при комнатной температуре в непрозрачной коробке. После инкубации кратковременно центрифугируйте ткань при скорости около 6000 об/мин.

Затем выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1,5 миллилитрах раствора для ванны. Перед началом экспериментов оставьте клеточную суспензию примерно на 30 минут для этерификации. Затем продолжайте одновременные измерения пластыря и эпифлуоресцентного кальция с использованием описанного протокола.

Миоциты выделяли из предсердной ткани и количественно определяли на предметном стекле микроскопа с помощью клеточного искателя. Средние выходы клеток ясно указывают на то, что существует тенденция к снижению выхода клеток в образцах от пациентов с хронической фибрилляцией предсердий. При гриппе три загруженных миоцита стимулировались с частотой 0,5 герц в текущей конфигурации зажима для выявления потенциалов действия, около 90% исследованных клеток показали регулярные сокращения.

В ответ на эту стимуляцию переключение на флуоресцентную микроскопию визуализирует потенциальное действие, вызванное высвобождением кальция из саркоплазматического ретикулума, что инициирует клеточное сокращение. Репрезентативные записи пациентов с синусовым ритмом и фибрилляцией предсердий показывают, что ср. Потенциалы действия пациента обычно имеют форму шипа и купола, в то время как триангуляция и укорочение потенциала действия являются типичными признаками ремоделирования предсердий.

У пациентов с фибрилляцией предсердий у пациентов с одновременным регистрированием внутриклеточных кальциевых транзиторов выявлено повышение диастолического уровня кальция и снижение амплитуды кальциевых переходных процессов в миоцитах у пациентов с фибрилляцией предсердий для регистрации кальциевых токов L-типа. Калийные токи блокировали с помощью четырех аминопаридина и хлорида бария. Элементы стимулировали при частоте 0,5 Гц в конфигурации клещей напряжения с использованием удерживающего потенциала минус 80 мВ с 100-секундным нарастанием до минус 40 мВ и 100-миллисекундным тестовым импульсом до 10 мВ.

Репрезентативные записи показывают, что фибрилляция предсердий связана со снижением тока кальция L-типа. Опять же, уровень диастолического кальция был повышен, в то время как амплитуда переходных процессов кальция была ниже. При фибрилляции предсердий.

Применение неселективного агониста бета-рецепторов надпочечников изопрена увеличивало амплитуды кальциевых токов L-типа и цитозольный кальциевый транзиент. В обеих группах это говорит о том, что клетки имеют неповрежденный каскад передачи бета-адренергического сигнала. Результаты показывают, что этот метод обеспечивает высокое качество толерантных к кальцию миоцитов, которые подходят для одновременного измерения пластырного зажима и измерения переходных процессов кальция.

Кроме того, полученные миоциты могут быть полезны для измерений укорачивания клеток, иммунного окрашивания или окрашивания TTU.