Выделение предсердия человека Миоциты для одновременных измерений Ca

Общая цель данной процедуры — выделение миоцитов предсердий человека, подходящих для одновременного измерения кальциевых транзиентов и мембранных токов. Образец правого предсердия получают от пациентов, переносящих операцию на открытом сердце, и быстро транспортируют для начала процедуры. Первым этапом процедуры является очистка ткани и ее разрезание на небольшие фрагменты.

Вторым этапом является двухкратное ферментативное расщепление ткани протеолитическими ферментами, в результате которого изолируются миоциты предсердий. Заключительный этап включает загрузку миоцитов флуоресцентным красителем, чувствительным к кальцию. В конечном итоге комбинированное использование эпифлуоресцентной микроскопии и метода локальной фиксации мембраны (patch clamp) позволяет проводить одновременную запись кальциевых транзиентов вместе с мембранными токами или потенциалами действия.

Этот метод может помочь в понимании молекулярной основы нарушений регуляции клеточного кальция, лежащих в основе таких сердечных заболеваний, как фибрилляция предсердий; демонстрировать метод будет Клаудия Лира, старший техник нашей лаборатории. Ткань предсердий человека, полученная от пациентов, перенесших открытую операцию на сердце для аортокоронарного шунтирования или замены митрального клапана, следует быстро транспортировать в лабораторию в транспортном растворе. По прибытии в лабораторию перенесите образец ткани и раствор в чашку Петри диаметром 10 сантиметров. Затем примерно удалите жировую ткань с помощью ножниц.

Затем взвесьте образец ткани. Оставьте от 200 до 600 mg для выделения клеток, а остальную часть заморозьте в жидком азоте для биохимического анализа. Перенесите ткань для выделения клеток в чашку с охлажденным раствором, не содержащим кальция, и измельчите ткань на фрагменты размером 1 мм³ для ее промывки.

Перенесите раствор вместе с безкальциевым раствором в стакан с рубашкой. Нагрейте до 37 °C. Подавайте кислород через линию, закрытую наконечником дозатора, чтобы предотвратить сильное пузырение.

Осторожно перемешивайте ткань в течение примерно трех минут с помощью магнитного перемешивающего элемента. Затем дайте ткани осесть. После этого осторожно профильтруйте супернатант через нейлоновый фильтр с размером пор 200 микрон.

Большая часть ткани должна остаться в стакане. Долейте в стакан подогретый до 37 °C раствор, не содержащий кальция. Затем с помощью пинцета перенесите отфильтрованные фрагменты ткани с сетки обратно в стакан и повторите процедуру промывки дважды.

Начните эту часть процедуры с приготовления 20 миллилитров подогретого до 37 °C раствора фермента E1, содержащего коллагеназу и протеазу. Осторожно отфильтруйте безкальциевый раствор после заключительного этапа промывки и суспендируйте промытую ткань в растворе E1. Перенесите ткань, собранную на сетке, обратно в стакан.

Осторожно перемешивайте суспензию в течение 10 минут. Затем добавьте 40 µL 10 мМ хлорида кальция и продолжайте перемешивание в течение 35 минут. После этого осторожно профильтруйте супернатант через нейлоновую сетку.

Большая часть ткани должна остаться в стакане. Приготовьте 20 миллилитров раствора фермента E2, содержащего только коллагеназу 1, и используйте его для долива стакана. Верните ткань, собранную на сетке, в стакан.

Затем сразу добавьте 40 µL 10 мM раствора хлорида кальция во время второго этапа переваривания, периодически используя ножницы для измельчения сгустков ткани. Через пять минут возьмите пробу суспензии для проверки диссоциации клеток под микроскопом. Продолжайте брать пробы каждые две-три минуты до тех пор, пока не станут четко видны палочковидные поперечнополосатые кардиомиоциты.

Затем прекратите перемешивание, чтобы ткань осела. После осаждения осторожно отфильтруйте супернатант через нейлоновую сетку в пластиковую пробирку объемом 50 milliliter. Далее суспендируйте ткань в 20 milliliters раствора для хранения и верните отфильтрованные фрагменты ткани с сетки в стакан.

Продолжите диссоциацию клеток путем осторожной механической тритурации. При использовании пипетки объемом 20 мл старайтесь избегать образования пузырьков. Затем аккуратно профильтруйте супернатант через нейлоновую сетку; после фильтрации центрифугируйте обе порции собранного супернатанта при 90 5G в течение 10 минут.

Чтобы осадить клетки, удалите супернатанты путем аспирации, не нарушая структуру осадка. Ресуспендируйте каждый осадок в 1,5 milliliters раствора для хранения при комнатной температуре. Затем добавьте в каждую пробирку 7,5 microliters 10 millimolar раствора хлорида кальция и выждите 10 минут.

Затем добавьте еще 7,5 µL хлорида кальция и подождите еще 10 минут. По истечении этого времени добавьте третью порцию 10 мМ хлорида кальция объемом 15 µL, чтобы довести конечную концентрацию хлорида кальция в растворе до 0,2 мМ. Целью данной изоляции является получение клеток, подходящих для измерения внутриклеточного кальция.

Следовательно, критически важно исключить любые кальциевые буферы, такие как EGGA, из раствора для хранения. Перенесите 1,5 milliliters клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку объемом два milliliter. Следующие этапы следует выполнять с учетом светочувствительности флуоресцентного индикатора кальция.

FluO-3. Сначала приготовьте 1 мM стоковый раствор FluO-3. Этот раствор можно хранить при температуре -20 °C до одной недели.

Затем добавьте 15 µL стокового раствора flu oh 3:00 AM к 1,5 мл клеточной суспензии. Осторожно перемешайте смесь и инкубируйте суспензию в течение 10 минут при комнатной температуре в непрозрачном боксе. После инкубации подвергните ткань кратковременному центрифугированию при примерно 6 000 об/мин.

Затем слейте супернадант и ресуспендируйте осадок в 1,5 миллилитрах ванночного раствора. Оставьте клеточную суспензию примерно на 30 минут для деэтерификации перед началом экспериментов. Затем приступите к одновременному проведению патч-кламп записи и эпифлуоресцентного измерения уровня кальция, используя описанный протокол.

Миоциты были выделены из ткани предсердий и подсчитаны с помощью микроскопа с системой поиска клеток на предметном стекле. Средний выход клеток четко указывает на тенденцию к снижению количества клеток в образцах, полученных от пациентов с хронической фибрилляцией предсердий. Загруженные Flu-O3 миоциты стимулировали с частотой 0,5 Гц в конфигурации фиксации тока для вызова потенциалов действия; примерно у 90% исследованных клеток наблюдались регулярные сокращения.

В ответ на данную стимуляцию переключение на флуоресцентную микроскопию позволяет визуализировать высвобождение кальция из саркоплазматического ретикулума, вызванное потенциалом действия, что инициирует сокращение клетки. Репрезентативные записи потенциалов действия пациентов с синусовым ритмом и фибрилляцией предсердий показывают, что потенциалы действия в норме имеют форму со спайком и куполом, тогда как триангуляция и укорочение потенциала действия являются типичными признаками ремоделирования предсердий.

Одновременная запись внутриклеточных транзиентов кальция у пациентов с фибрилляцией предсердий выявила повышенный уровень диастолического кальция и снижение амплитуды кальциевых транзиентов в миоцитах пациентов с фибрилляцией предсердий при записи кальциевых токов L-типа. Калиевые токи блокировали с помощью четырех-аминопиридина и хлорида бария. Стимуляцию клеток проводили с частотой 0,5 Гц в режиме voltage clamp, используя удерживающий потенциал -80 мВ с линейным изменением (ramp) до -40 мВ в течение 100 мс и тестовым импульсом до 10 мВ длительностью 100 мс.

Репрезентативные записи показывают, что фибрилляция предсердий связана со снижением кальциевого тока L-типа. Кроме того, уровень диастолического кальция был повышен, в то время как амплитуда кальциевого транзиента была ниже при фибрилляции предсердий.

Применение изопротеренола, неселективного агониста бета-адренорецепторов, привело к увеличению амплитуды кальциевых токов L-типа и цитозольных кальциевых транзиентов. В обеих группах это свидетельствует о наличии в клетках полноценного каскада передачи бета-адренергического сигнала. Результаты показывают, что данный метод позволяет получать высококачественные кальций-толерантные миоциты, подходящие для одновременного проведения локального притока тока (patch clamp) и измерения кальциевых транзиентов.

Кроме того, полученные миоциты могут быть полезны для измерения укорочения клеток, иммуноокрашивания или окрашивания TTU.