Жить анализ клеточного цикла

Общая цель этой процедуры заключается в измерении относительной фазы клеточного цикла и размера клеток тканей с генетически модифицированными и помеченными GFP или RFP у дрозофил. Сначала настроили генетические скрещивания для получения потомства, содержащего клетки, помеченные желаемыми флуоресцентными белками и желаемыми генетическими манипуляциями в конкретной ткани или популяции клеток. В процессе исследования необходимо чисто изолировать желаемую ткань от потомства соответствующей стадии развития, затем диссоциировать ткань до суспензии одной клетки и окрашивать жизнеспособным ДНК-красителем для измерения содержания ДНК.

Анализируйте окрашенные диссоциированные образцы с помощью проточной цитометрии. В конечном счете, результаты in vivo измеряют изменения в размере клеток и фазе клеточного цикла, вызванные изучаемыми генетическими манипуляциями. Основное преимущество данной методики перед существующим методом проточной цитометрии на живых тканях дрозофилы с использованием ультрафиолетовых красителей заключается в том, что цикл красителей фиолетового красителя совместим с менее дорогими настольными цитометрами, содержащими фиолетовый лазер 4005, которые можно приобрести с небольшим бюджетом и поддерживать в единых лабораторных масштабах.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточного цикла, предоставляя более подробную информацию о фазе клеточного цикла и размере клеток, чем просто измерение общего размера ткани и скорости пролиферации. Демонстрировать процедуру будут Кагель и Дан Сан, аспиранты из моей лаборатории, и Ольга Гуко. Наш техник Соберите зрелых личинок в третьем возрасте личинок примерно через 110-120 часов после откладки яиц для вскрытия личинок.

Точное определение зрачков имеет важное значение для исследований во время метаморфоза, для этого урожая белая предкуколка в начале метаморфоза, при необходимости, я запечатываю чашку Петри из кукол или пузырек с личинками в водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия для активации тепла. Флип-база Чака для клонов по отслеживанию родословной. После распечатывания чашки Петри поместите ее в инкубатор для выдержки до нужной стадии развития для рассечения зрачков.

Осторожно возьмите куколку за передний кончик зрачка, где есть пузырь воздуха, чтобы не повредить куколку внутри, расположите плавающую куколку для правильного захвата. Затем микроножницами аккуратно разрежьте задний кончик куколки под небольшим углом к спинной части животного, чтобы ослабить внутреннее давление, не заставляя заднюю часть жира проникнуть в нужные ткани в области грудной клетки, а голову аккуратно разрежьте вдоль спинной срединной полосы, избегая повреждения крыльев и переднего глаза мозгового комплекса, промойте его для удаления жира. Затем извлеките зрачок из зрачкового корпуса, взявшись щипцами за задний край эпидермиса зрачка и вытащив его из зрачкового корпуса.

Переложите препарированную куколку в чистую чашку для вскрытия. Проткните небольшое отверстие в кутикуле спереди глаза мозговым комплексом с помощью щипцов. С помощью стеклянной пипетки пасти с резиновой грушей.

Аккуратно промойте диссекционный раствор PBS через частично рассекреченную куколку, чтобы удалить оставшийся жир и кишечную ткань. Чтобы получить крылья зрачка, удерживайте куколку за голову одним щипцом с помощью второго щипца. Возьмитесь за самый задний кончик кутикулы крыла, потяните и вытесните его с боковой части туши.

Затем отрежьте или оттяните крыло за шарнир, чтобы снять его с тела и сложить в кучу подальше от туш и другого материала, чтобы получить зрачок, глаза или мозг. Мойте куколку до тех пор, пока глазной комплекс мозга не вытеснится и не освободится от куколки. С помощью щипцов аккуратно оттяните зрачок глаза от мозга и сохраните нужную ткань С помощью смазанной прошлой пипеткой аккуратно перенесите рассеченные ткани.

Инкубируйте пробирки с встряхиванием при температуре 23 градуса Цельсия при 500 об/мин в течение 70 минут. Затем осторожно перебейте образцы в течение пяти секунд со средней скоростью и верните образцы в шейкер еще на 15-20 минут. Vortex делает выборку еще раз в течение пяти секунд со средней скоростью для мозга и зрачковых глаз.

Старше 36 часов. PF диссоциируют ткани в растворе окрашивания ДНК при температуре 23 градуса Цельсия при 500 оборотах в минуту в течение 45-60 минут. Затем один за другим вручную диссоциируйте большие куски ткани, перенося их в чашку для препарирования вместе с примерно 50 микролитрами раствора для окрашивания ДНК.

пипетки вверх и вниз с помощью вручную проводимого мимо пипетки с отверстием примерно от 100 до 150 микрометров. Соберите диссоциированные образцы в пятимиллилитровую пробирку. Инкубируйте еще 30 минут при температуре 23 градуса Цельсия с встряхиванием при 500 об/мин.

Визуально убедитесь, что образцы полностью диссоциированы. Помните, что бесклеточный прозрачный зрачок с кутикулой крыла не будет ассоциироваться. Начните анализ факса с загрузки образца на цитометр.

Затем выберите каналы для обнаружения прямого и бокового рассеяния, указывающих на размер ячейки и сложность мембраны. Чтобы обнаружить фиолетовое окрашивание ДНК по D-циклу, вам потребуется измерить высоту, ширину и площадь VL от возбуждения фиолетовым лазером. Также выберите синий лазерный канал в одной области для измерения флуоресценции GFP.

Для анализа RFP мы используем синий лазерный канал три. Этот канал на attune оптимизирован для обнаружения RFP. Установите затворы для того, чтобы ограничить анализ выбранной популяцией и ограничить количество мусора и продавать скопления из анализа, который генерирует стоп-графики с помощью первого затвора, исключить мусор и скопления на графике SSC по сравнению с FSC на графике VL 1 и VL 1 с использованием GA 2 для исключения неокрашенных клеток sub G 1 апоптотических клеток и клеточных скоплений на основе идентификации синглетов.

GA 3 включает клетки в пределах первого и второго ворот, которые являются GFP-отрицательными на графике зависимости флуоресценции от содержания ДНК на основе VE L первого роста. Следующая четвертая ступень включает в себя клетки внутри ворот 1 и 2, которые являются GFP-положительными на графике зависимости флуоресценции от содержания ДНК. Можно также сгенерировать вентили 5 и 6 из точечных графиков размера ячейки, измеренного через GFP в зависимости от прямого рассеяния.

Чтобы изучить фазировку клеточного цикла, используйте две гистограммы, которые отображают содержание ДНК по оси x и количество клеток на Y-образной оси для популяций, определенных третьим и четвертым вентилями. Для размера ячейки гистограммы устанавливают популяции на вентили 5 и 6, а также строят FSC по оси X и подсчитывают по оси Y при выполнении выборок, устанавливают остановку записи на 10 000. Положительные события GFP также установили объем сбора в 300 микролитров.

Соответствующие настройки порога и напряжения содержатся в предоставленных шаблонах. Прогоните образцы со стандартной или высокой чувствительностью 100 микролитров в минуту и запишите. Записанные файлы данных, генерируемые программным обеспечением Attune, имеют формат FCS, совместимый с большинством программного обеспечения для моделирования клеточного цикла.

Это репрезентативное рабочее пространство, содержащее четыре точечных графика и две гистограммы, показывает образец крыла личинки, экспрессирующий GFP и циклин D в заднем крыле, управляемый трансгеном Grailed gal 4. Первая точечная диаграмма размера клеток с походкой исключает мусор и комки. Второй точечный график дискриминирует синглеты с походкой два, чтобы исключить неокрашенные клетки ниже G 1D NA и скопления на графике GFP и содержания ДНК.

Можно различить отрицательные и положительные клетки GFP, а также определить содержание двух N и четырех NDNA на основе положения вдоль оси x. Этот график размера ячейки, измеренного с помощью GFP в зависимости от прямого рассеяния, используется для создания вентилей номер пять и шесть. Полученные анализы приводят к сопоставлению гистограмм содержания ДНК в сравнении с подсчетами для GFP или RFP-отрицательной популяции, а также GFP или RFP-положительных клеток.

С помощью предоставленного шаблона RFP. Аналогичные результаты получаются при том же типе ткани и характере экспрессии. Для RFP предоставленные шаблоны и напряжения подходят для анализа глаз, мозга и крыльев личинок, а также зрачковых глаз, мозга и крыльев.

В настроенном программном обеспечении. Использование функции автомасштабирования для гистограмм клеточного цикла или размера ячейки позволяет определить глобальный максимум для каждой популяции. Эти профили клеточного цикла представляют собой GFP-положительные и отрицательные клетки в глазах личинок, экспрессирующие GFP в задней части.

Используя четыре трансгена U-A-S-G-F-P в GMR GAL, наложение выявляет различия в фазировке клеточного цикла задних клеток, экспрессирующих GFP. Также можно построить график относительного изменения размера клеток между положительными и отрицательными клетками GFP. Этот профиль клеточного цикла был получен из мозга зрачков при 46 часах ПФ. GFP-положительные клетки представляют собой клоны, отслеживающие линию, экспрессирующие регулятор G one S, циклин D и E two F, которые нарушают покой и приводят к вхождению в S-фазу.

Это контрастирует с неэкспрессирующимися GFP-отрицательными клетками, которые на этой стадии обычно арестованы. В G one программное обеспечение attune генерирует определенные пользователем области на гистограммах, обозначая G одну фазу и две фазы. Таблица статистики для каждого запуска определяет абсолютное количество ячеек в определенных пользователем областях и процентах.

В качестве альтернативы можно использовать программное обеспечение для моделирования, такое как mod fit, для оценки процентов в каждой фазе, а также апоптотических ячеек. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделить и пометить несколько тканей дрозофилы для анализа клеточного цикла.