РНК предсказание вторичной Структура Использование высоких-пропускная способность SHAPE

Общей целью этой процедуры является предсказание вторичной структуры РНК с однонуклеотидным разрешением. Это достигается путем предварительной химической модификации свернутой РНК электрофильным реагентом, который S изолирует одноцепочечные или гибкие участки РНК. Второй шаг заключается в использовании обратной транскрипции для обнаружения участков РНК, которые были химически модифицированы.

Далее продукты CD NA обратной транскрипции фракционируют методом капиллярного электрофореза. Заключительным этапом является обработка и нормализация данных. В конечном счете, программное обеспечение для структурирования РНК используется для прогнозирования вторичной структуры РНК с использованием ограничений псевдосвободной энергии, полученных в результате анализа формы.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области молекулярной биологии, например, как структура РНК управляет функциями каталитических и несуществующих РНК и как геномы вирусных РНК регулируют многофункциональность своих геномов. Применение этого метода распространяется на нашу терапию и диагностику вирусных заболеваний или рака, потому что понимание вторичной структуры РНК может помочь в разработке структурных лекарств. Хотя этот метод дает представление о структуре РНК, полученных в результате транскрипции in vitro, он также может быть применен in vivo, поскольку реагенты формы проницаемы для клеток.

Перед началом этой процедуры подготовьте РНК методом транскрипции in vitro. Использование коммерческого комплекта для расшифровки. РНК следует хранить в TE-буфере при температуре от минус 20 до минус 80 градусов Цельсия в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 микролитра.

Разбавьте 12 пико-молей РНК до 18 микролитров водой и добавьте два микролитра 10-кратной натуральной буферной смеси, постукивая по пробирке, с последующим кратковременным вращением нагрейте смесь в пробирке до 85 градусов Цельсия в течение одной минуты, затем охладите до четырех градусов Цельсия со скоростью 0,1 градуса Цельсия в секунду. Добавьте 100 микролитров воды и 30 микролитров пятикратного складного буфера в микроцентрифужную пробирку. После этого инкубируйте содержимое пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30–60 минут в зависимости от сворачиваемой РНК.

Как правило, магниезависимое сворачивание более длинных и структурированных РНК требует более длительного времени инкубации Перенесите 72 микролитра аликвоты в каждую из двух 0,5-миллилитровых микроцентрифужных пробирок, которые должны быть помечены как модифицированные и контрольные соответственно. Следующим шагом является добавление восьми микролитров безводного диметилсульфоксида в контрольную смесь и отставление в сторону. Затем добавьте в модифицированную смесь восемь микролитров 10 х и MIA.

Инкубируйте модифицированную и контрольную смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 50 минут. Добавьте восемь микролитров трех ацетата натрия, pH 5,28 микролитров 100 миллимолярных ЭДТА, 240 микролитров холодного этанола и один микролитр 10 миллиграммов на миллилитр. Гликоген в модифицированную смешанную пробирку для осаждения модифицированной РНК охлаждают содержимое пробирки в течение двух часов при температуре минус 20 градусов Цельсия, а затем центрифугируют при 14 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.

Затем дважды промойте гранулу холодным центрифугированием из 70% этанола в течение пяти минут. После каждой промывки удаляйте надосадочную жидкость с помощью микропипетки и сушите гранулу на воздухе в течение пяти минут. При комнатной температуре подготовить модифицированные и контрольные образцы для обратной транскрипции в микроцентрифужных пробирках объемом 0,5 мл.

Для модифицированной реакции смешайте пять микролитров модифицированной РНК, шесть микролитров воды и один микролитр 10 микромолярного раствора праймера sci с пятью мечеными. Для контрольной реакции смешайте пять микролитров контрольной РНК, шесть микролитров воды и один микролитр 10 микромолярного раствора праймера, меченного sci 5,5. Поместите трубки в термоамплификатор и встаньте на колени с праймером к РНК.

Во время стояния на коленях приготовьте 2,5 x RT mix. Для каждой реакции RT хорошо перемешайте и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут, прежде чем добавить в реакцию стояния на коленях. Как только температура реакции коленопреклонения достигнет 50 градусов по Цельсию, добавьте восемь микролитров 2,5 XRT.

Перемешайте и выдержите в течение 50 минут при температуре 50 градусов Цельсия. Далее гидролизуют РНК путем добавления одного микролитра четырех моляров гидроксида натрия и нагревания до 90 градусов Цельсия в течение трех минут. Охладите реакции на льду, а затем нейтрализуйте их, добавив два микролитра двух молярных соляной кислоты.

Теперь совместите модифицированную и контрольную реакции и добавьте 0,1 объема, или одну 10-ю от общего объема реакции, три моляра ацетата натрия и 100 миллимоляров ЭДТА, 1,5 объема холодного этанола и один микролитр 10 миллиграмм на миллилитр. Гликоген. Это приводит к выпадению CDNA в осадок из раствора. Охладите раствор в течение двух часов, затем центрифугируйте при 14 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.

Дважды промыть гранулу холодным 70%-ным этанолом ресуспендировать, гранулированный CD NA в 40 микролитрах деионизированной формы амида путем нагревания до 65 градусов Цельсия в течение 10 минут, с последующим энергичным вортексированием в течение не менее 30 минут для приготовления реакции секвенирования в микроцентрифужной пробирке объемом 0,5 миллитра, 40 микролитров терминирующей смеси DDA. Пять молей PICA матрицы ДНК, 4,6 микролитра 10-кратного буфера и 10 микролитров хорошо читаемого праймера D с двумя мечеными буквами. К этой смеси добавьте 4,6 микролитра QUIN A и разведите водой, чтобы довести общий объем до 82 микролитров.

Приготовьте вторую реакцию секвенирования таким же образом, используя вместо этого ДДТ и меченый праймер Lycor IR 800. Далее приступают к амплификации ПЦР с использованием заданных рекомендованных по USB условий. Добавьте 16 микролитров трехмолярного ацетата натрия pH 5,2, 16 микролитров 100 миллимолярного ЭДТА, один микролитр 10 миллиграммов на миллилитр гликогена и 480 микролитров 95% этанола для осаждения ДНК, затем инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут и центрифугируйте при 14 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.

Ресуспендируйте гранулированный CD NA в 100 микролитрах деионизированной формы амида путем нагревания до 65 градусов Цельсия в течение 10 минут с последующим энергичным вортексированием в течение не менее 30 минут. Затем смешайте 40 микролитров объединенных образцов с 10 микролитрами объединенных лестниц для секвенирования и пипеткой наберите общий объем образца по программе 96 луночных планшетов для образцов, подготовьте инструмент для капиллярного электрофореза и начните прогон в соответствии с инструкциями производителя. Четыре перекрывающиеся цветные дорожки образуются в результате миграции четырех наборов продуктов реакции через капилляр следующим образом: синяя кривая показывает продукты обратной транскрипции, полученные из обратной транскрипции модифицированных NMIA РНК.

Зеленый след показывает продукты обратной транскрипции из свернутых, но в остальном немодифицированных РНК. Черная трассировка показывает лестницу секвенирования D-N-A-D-D-G, а красная трасса показывает лестницу секвенирования ДДТ. Необработанные следы капиллярного электрофореза разделяются, обрабатываются, выравниваются и интегрируются с помощью программного обеспечения для определения формы.

Анализ данных начинается с импорта электроферограмм из системы капиллярного электрофореза в искатель формы. Центральное окно просмотра данных обеспечивает графическую обратную связь по каждому шагу обработки данных. В окне инспектора инструментов, расположенном в левом нижнем углу экрана, отображаются параметры для инструментов, выбранных в инспекторе скриптов.

Инспектор сценариев в верхней части экрана отображает те инструменты, которые были применены к данным, корректирует электроферограммы для коррекции флуоресцентного фона, спектрального перекрытия между флуоресцентными каналами, сдвигов подвижности, придаваемых по-разному помеченным праймерам, затухания сигнала в результате преждевременного прекращения обратной транскрипции и различий в интенсивности флуоресценции обычных продуктов, помеченных разными флуорофорами в инструменте выравнивания и интеграции формоискателей. Используйте функцию настройки для автоматического присвоения идентичностей отдельным пикам и соотнесения этой информации с последовательностью РНК, определенной пользователем, и двумя лестницами секвенирования, чтобы включить профили реакционной способности нуклеотидов в алгоритм вторичной структуры, используемый программным обеспечением для структуры РНК 5.3, и/или сравнить профили близкородственных РНК. Стандартизируйте данные формы в стандартизированном виде.

Для этого исключите выбросы из последующих расчетов. Определите эффективный максимум реактивности и нормализуйте, разделив все значения реактивности на эффективный максимум. Программное обеспечение для структурирования РНК используется для прогнозирования экспериментально подтвержденных вторичных структур РНК с использованием ограничений псевдосвободной энергии, полученных при анализе формы.

Программное обеспечение обеспечивает графическое представление структур DRNA с наименьшей энергией, а также текстовое представление этих структур. В точечной скобке последовательность и аннотация в виде точечных скобок должны быть импортированы в просмотрщик структуры РНК, показанный здесь, представляет собой 2D-структуру второго участка стволовой петли ответа на ВИЧ, сгенерированную в структуре РНК 5.3 с использованием полученных профилей реактивности по форме и визуализированную с помощью облегченного апплета Java. Нуклеотиды, окрашенные в синий цвет, имеют низкую реакционную способность, в то время как нуклеотиды, окрашенные в красный цвет, имеют более высокую реакционную способность.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что результирующая модель РНК должна быть тщательно интерпретирована, прежде чем прийти к окончательным выводам о вторичной структуре РНК после этой процедуры. Другие методы, такие как использование гидроксирадикального зондирования с помощью методов пространственного расщепления, могут быть выполнены для выяснения сложных третичных взаимодействий и, в конечном итоге, позволят исследователям определить структуры этих РНК в трех измерениях.