Мышь Краткосрочные и долгосрочные двигательную активность Анализируемый видео отслеживания программного обеспечения

Общая цель данного эксперимента заключается в выявлении различий в краткосрочной и/или долгосрочной локомоторной активности между различными группами экспериментально обработанных мышей. Это достигается путем видеорегистрации активности мышей в домашних клетках в режиме реального времени. На втором этапе локомоторная активность животных анализируется в реальном времени или по записи с использованием программного обеспечения для видеотрекинга.

Затем полученные показатели локомоторной активности импортируются в дополнительное программное обеспечение для статистического анализа. Таким образом, данная процедура позволяет выявить влияние воздействий или условий на краткосрочную и долгосрочную локомоторную активность на основе таких оцениваемых параметров, как пройденное расстояние, скорость перемещения и продолжительность движения. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими способами, такими как подсчет пересечений линий или имплантация эмиттера, является возможность более детального изучения локомоторной активности мышей без необходимости проведения инвазивной и потенциально искажающей результаты хирургической операции.

Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как настройка клеток и оборудования для обеспечения оптимального качества изображений, необходимого для последующего видеотрекинга, может быть трудоемкой и потребовать времени на освоение. Краткосрочная локомоторная активность оценивается в домашних клетках изолированных мышей с наполнителем, который обладает высоким контрастом по отношению к кодовому цвету животного. Перед началом эксперимента животные должны пройти акклиматизацию к наполнителю в течение не менее 24 часов.

Для подготовки помещения для тестирования начните с установки видеокамеры с функцией ночного видения и объемом памяти не менее 120 гигабайт над зоной записи. Уровень фонового шума в помещении не должен превышать 70 децибел. Если периодический фоновый шум неизбежен, используйте генератор белого шума, чтобы заглушить эти звуки.

Также важно, чтобы условия окружающей среды в помещении для тестирования были аналогичны обычным условиям содержания животных. Перед размещением новых подопытных животных очистите зону регистрации, затем застелите поверхность оберточной или лабораторной бумагой того же цвета, что и наполнитель в клетке. Далее установите непрозрачные разделители для клеток, изготовленные из пластика толщиной 0,5 дюйма. Разделители на тестовой поверхности должны быть чистыми и иметь цвет, аналогичный цвету наполнителя.

Теперь перенесите мышей в зону тестирования и установите их клетки между разделителями. Для удобства анализа всегда располагайте клетки одинаково. Для проведения теста накройте клетки прозрачным плексигласом толщиной 1/4 дюйма.

В оргстекле должно быть как минимум 11 отверстий диаметром четверть дюйма для обеспечения надлежащей вентиляции. Затем установите лампы-грелки с красными колбами для освещения клеток. Теперь центрируйте ракурс камеры на тестовых клетках, не выходя за пределы технических возможностей системы видеотрекинга.

Данная система позволяет отслеживать до восьми мышей в режиме реального времени. Теперь, глядя на изображение с видеокамеры, отрегулируйте угол и положение осветителей, чтобы устранить блики или отражения от плексигласовых крышек клеток. Получение чистого изображения мышей без каких-либо визуальных артефактов является наиболее критическим этапом для достижения качественных результатов.

Всегда включайте в каждую группу как экспериментальных, так и контрольных субъектов, чтобы свести к минимуму потенциальное влияние временных различий в LMA. Непосредственно перед тестированием удалите из клеток любые материалы для гнездования и обогащения среды, так как они могут перекрывать обзор мыши. В видеозаписи начните запись с грифельной доски, на которой указана соответствующая экспериментальная информация.

Для обеспечения правильной идентификации видеозаписи используйте таймер на дисплее камеры для отслеживания продолжительности теста и не попадайте в поле зрения животного во время записи. По завершении теста верните все материалы в каждую клетку.

Если животных планируется протестировать повторно, восстановите им доступ к пище и воде в перерывах между тестами. Сохраните видеозаписи сессии тестирования на архивном носителе, совместимом с системой видеотрекинга, например, на жестком диске. В системе видеотрекинга проведите анализ видео в режиме реального времени. Для начала выберите всю площадь дна клетки в качестве области интереса или ROI для отслеживания.

Для проведения расширенного анализа, например, оценки налогов Фигмы, создайте несколько внутриклеткочных областей интереса (ROI) для высокопроизводительных исследований. Анализируйте все клетки в видео одновременно, используя отдельные ROI для пола каждой клетки. Настройте VTS для расчета общего расстояния, скорости и продолжительности перемещений. После завершения расчетов экспортируйте данные в файл электронной таблицы для хранения и дальнейшего анализа.

Долгосрочное тестирование проводится так же, как и краткосрочное. Однако оно требует модифицированной клетки с новой точкой доступа к пище и воде. Сначала прорежьте отверстие диаметром 5.5 сантиметров в короткой торцевой стенке стандартной клетки.

Далее в оцинкованной стальной сетке с ячейкой 1/4 дюйма прорежьте отверстия диаметром 1/2 дюйма и загладьте края сетки с помощью такой же сетки, чтобы удалить острые заусенцы; изготовьте внешний бункер для кормовых гранул, который можно будет закрепить на сетке над отверстием. Затем сделайте отверстия для заклепок. После этого закройте отверстие в клетке сеткой и прикрепите бункер, используя алюминиевые заклепки и шайбы из нержавеющей стали.

Для обеспечения гидратации изготовьте поилку из стандартной конической пробирки объемом 50 milliliter и одноотверстной резиновой пробки с расширенным отверстием для возможности вставки бескапельной поилки-трубки. Закрепите эту поилку на клетке.

С помощью липучки-велкро заборную трубку следует вставить через отверстие, закрытое сеткой. Теперь, когда клетка накрыта крышкой из плексигласа, мыши сохраняют доступ к пище и воде в соответствии с теми же процедурами, которые были описаны для краткосрочного теста локомоторной активности. Длительный тест обычно проводится в течение 12 часов или в течение текущей фазы цикла свет-темнота.

Долгосрочное тестирование локомоторной активности обычно анализируется в режиме реального времени без видеозаписи. Тем не менее, запись можно вести с помощью дополнительной камеры или через DVD-рекордер, подключенный к основной камере. Мышей можно тестировать в течение всего времени, которое позволяют возможности системы видеотрекинга; как и при краткосрочном тестировании, из клетки удаляется только обогащающий материал для гнезда, но не кукурузный или опилочный наполнитель.

В VTS настройте систему видеотрекинга для анализа в режиме реального времени. Установите область интереса (ROI) так, чтобы она охватывала весь пол для каждой записываемой клетки. Как и в случае с краткосрочным анализом, настройте систему на расчет общего пройденного расстояния, скорости перемещения и продолжительности движения.

После завершения анализа экспортируйте данные в электронную таблицу для хранения и последующей обработки с использованием повторных краткосрочных тестов локомоторной активности. Было обнаружено, что после инъекции липополисахарида мыши, содержавшиеся в индивидуально вентилируемых клетках (IVC), быстрее восстанавливались после снижения краткосрочной локомоторной активности (LMA), вызванного инъекцией, чем мыши, содержавшиеся в клетках с окружающей средой (EC). Хотя первоначальное снижение локомоторной активности было схожим в обеих группах, получивших LPS, возвращение к базальному уровню локомоторной активности происходило более стремительно. В группе мышей, содержавшихся в IVC, более быстро восстанавливались также скорость и продолжительность движений.

В данном анализе отслеживание начиналось при обнаружении движения со скоростью 2 сантиметра в секунду и прекращалось при скорости 1,75 сантиметра в секунду с использованием переменных детектирования. Было проведено небольшое тестирование локомоции в течение двух последовательных 12-часовых циклов активности. У мышей нормального фенотипа не было обнаружено значимых различий в пройденном расстоянии, скорости или продолжительности движений.

Если при повторении исследования с большим размером выборки сохранится тенденция к отсутствию измеримых различий, полученные данные позволят предположить, что данный анализ может быть использован вместо имплантируемых передатчиков, применяемых для долгосрочного изучения локомоторной активности. При выполнении данной процедуры крайне важно уделять особое внимание условиям содержания животных перед началом эксперимента. Все экспериментальные и контрольные животные должны находиться в схожих условиях окружающей среды, особенно в отношении светового цикла, температуры в помещении и относительной влажности.

Кроме того, после данной процедуры следует свести к минимуму воздействие шумовых и ольфакторных раздражителей. Для ответов на дополнительные вопросы, например, приводит ли воздействие в конкретном эксперименте к развитию депрессивноподобного поведения без влияния на общую локомоторную активность, могут быть использованы другие методы, такие как тест принудительного плавания.