Одновременное пред-и пост-синаптические Электрофизиологические Запись с

Общая цель данной процедуры — получение первичных культур синаптически связанных спинальных нейронов и мышечных клеток из эмбрионов Xenopus. Это достигается путем предварительного стимулирования размножения Xenopus путем инъекции человеческого хорионического гонадотропина самцам и самкам лягушек с последующим сбором оплодотворенных икринок. Вторым этапом является удаление желеобразной оболочки, желточного пузыря и мембран из эмбрионов 22-й стадии.

Затем из эмбрионов изолируют спинальные нейроны и мышцы, после чего кожу удаляют и утилизируют. Заключительным этапом является высев изолированных клеток в культуральные чашки для формирования функциональных нервно-мышечных соединений. В конечном итоге наличие функциональных синаптических связей можно подтвердить с помощью одновременной парной локальной фиксации потенциала (patch clamp) нейронов и мышечных клеток в культуре.

Преимущество данного метода заключается в получении легкодоступного синаптического препарата позвоночных. Его можно использовать для мониторинга высвобождения нейромедиаторов с помощью постсинаптических электрофизиологических записей при одновременном измерении содержания пресинаптических ионов. Кроме того, методы просты и понятны, не требуют специального оборудования, помимо диссекционного микроскопа, а полученные культуры впоследствии могут храниться при комнатной температуре в простой питательной среде.

Данная препаровка может быть полезна для решения ключевых вопросов в области синаптической физиологии, включая механизмы связи пресинаптических биохимических и биофизических событий с высвобождением нейромедиатора. Кроме того, она применима для изучения нейромодуляции, синаптогенеза и синаптической пластичности. Для начала процедуры приготовьте необходимые растворы в соответствии с сопроводительной рукописью. Затем изготовьте как минимум два инструмента для микродиссекции, приклеив иголку для закрепления образцов к концу стеклянной пастеровской пипетки.

С помощью акрилового клея Sano закрепите шпильку так, чтобы её острый конец выступал за край пипетки примерно на 0.5 сантиметров. За два дня до подготовки культур выберите пару XUS, готовую к размножению, по следующим признакам: ярко выраженная красноватая «айка» (claw aika) на передних лапах самки и темная пигментация на плоской поверхности передних лап самца. Затем поймайте каждую лягушку сачком и удерживайте её в раковине брюшной стороной вниз, прижимая сачком так, чтобы животное не могло выбраться.

Введите один миллилитр HCG через сеть подкожно в один из дорсальных лимфатических мешков, чтобы животные не растоптали только что отложенные оплодотворенные икринки. Установите сетчатое дно с размером ячейки 0,5 дюйма на высоте 1–2 дюймов от дна аквариума. Затем поместите размножающуюся пару вместе в закрытый аквариум с водой объемом 10 галлонов.

Оставьте лягушек в покое от 12 до 48 часов, пока на дне под сеткой не появятся оплодотворенные икринки. Затем извлеките животных из аквариума, но не тревожьте икру еще как минимум 24 часа. Эту пару лягушек можно будет снова использовать для разведения через шесть недель.

Затем отделите эмбрионы от дна резервуара и перенесите их в четыре или пять культуральных чашек размером 60 × 15 мм, содержащих 10% физиологического раствора. Рассортируйте эмбрионы по стадиям развития согласно схеме Ньюкупа и Фабера. Эмбрионы с гладкой поверхностью и светло-коричневой или белой пигментацией, подобные тем, что показаны слева, являются идеальными. С другой стороны, эмбрионы с крупными черными или белыми пятнами, как на изображениях справа, обычно нездоровы и непригодны для использования.

Внутри ламинарного шкафа промаркируйте и заполните примерно наполовину стерильные чашки для культивирования размером 360×15 мм 10% раствором NaCl, а одну чашку — средой CMF. С помощью стерильной стеклянной пастернаужной пипетки перенесите от пяти до десяти эмбрионов стадии 22–24 в одну из чашек с 10% раствором NaCl. Под стереоскопическим диссекционным микроскопом внутри шкафа удалите желеобразную оболочку и вителлиновую мембрану с каждого эмбриона, используя два стерильных пинцета. Промойте очищенные эмбрионы, последовательно перенося их через две оставшиеся чашки с 10% раствором NaCl и, наконец, в чашку со средой CMF.

Затем осторожно, но крепко зажмите каждый эмбрион пинцетом и с помощью инструмента для микродиссекции удалите нейронную трубку и связанные с ней миотомы, которые расположены на самой дорсальной стороне животного. Для этого сделайте три разреза: по одному с каждого конца нейронной трубки и третий — непосредственно вентральнее нее. Затем переместите каждый диссецированный комплекс «нейронная трубка — миотомы» на чистый участок чашки, подальше от гранул желтка и другого детрита.

Примерно через 15 минут пребывания в CMF с помощью пинцета отделите пигментированную кожу от препарированной ткани и удалите кожу. Еще через 30–60 минут клетки, отделяясь друг от друга, образуют осадок в виде «песчаной кучки». Для данной процедуры разморозьте пробирку объемом 10 milliliter с культуральной средой, затем добавьте 70 microliters ITS в концентрации 35 nanograms per milliliter, BDNF и заполните стерильные чашки для культивирования диаметром 35 millimeter примерно наполовину культуральной средой L 15.

Используйте по одной чашке для культивирования для каждого препарированного эмбриона. Чтобы изготовить пипетку для посева, зажмите оба конца стеклянной пастеровской пипетки и поместите конусообразную часть над пламенем. Затем растяните концы примерно на 10 сантиметров.

Затем отломите кончик, чтобы получить наконечник размером примерно 0.2 мм. После этого с помощью посевной пипетки всосите скопление песка с одного эмбриона. Старайтесь минимизировать объем засасываемого раствора.

Затем вынесите клетки на дно культуральной чашки и распределите их несколькими линиями. Оставьте чашки с высеянными клетками в покое минимум на 15 минут, чтобы клетки успели прикрепиться к поверхности чашки. Через 12–24 часа культивирования у высеянных клеток появятся выраженные морфологические признаки.

Например, мышечные клетки приобретают веретенообразную форму, а спинальные нейроны развивают длинные отростки. Наличие функционального синаптического контакта между варикозными расширениями и мышечными клетками можно подтвердить с помощью одновременных парных электрофизиологических записей. Для этого подготовьте два патч-электрода для регистрации: один для пресинаптического варикозного расширения, другой — для мышечной клетки.

Затем заполните пресинаптический электрод раствором, содержащим info terin, а постсинаптический электрод — внутренним калиевым раствором. После этого замените среду в чашке с культурой на NFR. Затем перенесите ее на инвертированный микроскоп, оснащенный оптикой фазового контраста; установите пэч-зажим на пресинаптическое расширение (варикозитет) с помощью электрода, содержащего амфотерицин, и на постсинаптическую мышечную клетку с помощью другого электрода, чтобы подтвердить функциональность синапса; деполяризуйте варикозитет с помощью усилителя пэч-клампа и зарегистрируйте одновременные пресинаптические и постсинаптические токи.

На данном рисунке представлены клетки и культура сразу после посева при пятикратном увеличении, а также та же культура при 40-кратном увеличении. Здесь показан нервно-мышечный синапс в культуре, на котором видны сома нейрона, пресинаптическое расширение (варикозитет) и постсинаптическая мышечная клетка. Также здесь представлены пресинаптические и постсинаптические токи.

В ответ на ступенчатое повышение напряжения с шагом 10 мВ, прикладываемое к пресинаптическому варикозу в диапазоне от -30 мВ до +40 мВ, поддерживающий потенциал для обеих клеток составлял -70 мВ. После освоения эта методика может быть выполнена примерно за два часа. Жизнеспособные клеточные культуры можно получить уже через 24 часа, и они могут поддерживаться в течение нескольких дней. Данная модель используется уже несколько лет, помогая раскрыть некоторые фундаментальные свойства нервно-мышечной передачи.

Мы надеемся, что это видео будет способствовать дальнейшим открытиям, помогая исследователям более детально ознакомиться с этим мощным и простым методом.