Одновременное пред-и пост-синаптические Электрофизиологические Запись с Xenopus Нервно-мышечного Co-культуры

Общей целью этой процедуры является получение первичных культур синаптически связанных спинномозговых нейронов и мышечных клеток из эмбрионов xenopus. Это достигается путем сначала индуцирования размножения у ксенопуса путем инъекции хорионического вещества человека в атропин как самцам, так и самкам лягушек и сбора оплодотворенных яиц. Вторым шагом является удаление желейной оболочки и фателя и оболочек у эмбрионов 22 стадии.

Затем спинномозговые нейроны и мышцы изолируются от эмбрионов, а кожа удаляется и отбрасывается. Заключительным этапом является помещение изолированных клеток в чашки для культивирования и обеспечение формирования функциональных нервно-мышечных соединений. В конечном счете, функциональные синаптические связи могут быть продемонстрированы с помощью одновременных парных записей патч-фиксов от нейронов и мышечных клеток в культуре.

Прелесть этой техники заключается в том, что она дает легкодоступный синаптический препарат позвоночных. Его можно использовать для мониторинга высвобождения нейротрансмиттеров с помощью постсинаптических электрофизиологических записей с одновременным измерением появления пресинаптических ионов. Кроме того, методы являются четкими и простыми, не требующими специального оборудования, кроме препарирующего микроскопа, а затем культуры могут храниться при комнатной температуре в простой среде для культивирования.

Эта подготовка может быть полезна для ответа на ключевые вопросы в области синаптической физиологии, в том числе о том, как пресинаптические, биохимические и биофизические события связаны с высвобождением нейромедиаторов. Кроме того, он также полезен для изучения нейромодуляции синаптогенеза и синаптической пластичности. Затем изготовьте как минимум два инструмента для микродиссекции, приклеив булавку минухина к концу стеклянной пипетки для кондитерского теста.

С помощью акрилового клея Sano позвольте острому концу булавки выйти за конец пипетки примерно на 0,5 сантиметра. За два дня до подготовки культур определите готовую к размножению пару XUS, наблюдая за заметным красноватым когтем айка на самке и темной пигментацией на плоской поверхности передних лап самца. Далее подставьте сетку каждой лягушке и удерживайте ее брюшной стороной вниз в раковине вместе с сачком, чтобы она успела сбежать.

Введите один миллилитр ХГЧ через сетку и подкожно в один из дорсальных лимфатических мешков, чтобы животные не затоптали только что отложенные и оплодотворенные яйца. Установите экранированный пол с размером ячеи в полдюйма, установленный на один-два дюйма на дно бака. Затем поместите размножающуюся пару вместе в закрытый резервуар с водой объемом 10 галлонов.

Оставьте лягушек в покое на 12-48 часов, пока оплодотворенные яйца не будут замечены на полу под экраном. Затем извлеките животных из аквариума, но оставьте яйца в покое еще как минимум на 24 часа. Эту пару лягушек можно повторно разводить через шесть недель.

Далее освободите зародыши от дна емкости и переложите их в четыре или пять посуды для культуры размером 60 на 15 миллиметров, содержащие 10% физиологического раствора. Отсортируйте эмбрионы по стадиям в соответствии со схемой новых эмбрионов купе и Faber, которые выглядят гладкими на вид, с светлым, коричневым и белым моделированием, как слева, являются идеальными. С другой стороны, эмбрионы с большими черными или белыми пятнами, как справа, как правило, нездоровы и непригодны для использования.

Внутри колпака с ламинарным потоком наклейте этикетку и заполните примерно наполовину стерильные чашки для культивирования размером 360 на 15 миллиметров 10% физиологическим раствором и одну CMF. С помощью стерильной стеклянной пастечной пипетки перенесите от 5 до 10 эмбрионов стадии с 22 до 24 в одну из чашек, содержащих 10% физиологического раствора, с помощью восьмерки стереозум-препарирующего микроскопа внутри капюшона, удалите желейную оболочку и флюедную мембрану с каждого эмбриона с помощью двух пар стерильных щипцов. Промойте голые эмбрионы, пропустив их по одному через оставшиеся две чашки с 10% солевым раствором, и, наконец, в чашку, содержащую CMF.

Затем осторожно, но крепко удерживайте каждый эмбрион с помощью щипцов и используйте инструмент для микродиссекции, чтобы удалить нервную трубку и связанные с ней миотомы, которые расположены в самой дорсальной части животного. Для этого сделайте три среза, по одному на каждом конце от места расположения нервной трубки, а третий прямо вентрально по отношению к ней. Затем переместите каждую рассеченную миотому нервной трубки в чистую часть посуды подальше от гранул желтка и другого мусора.

Примерно через 15 минут в CMF используйте щипцы, чтобы освободить пигментированную кожу от рассеченной ткани и удалить кожу. Еще через 30-60 минут клетки образуют кучу песка, поскольку они диссоциируются друг от друга. В этой процедуре разморозьте 10-миллилитровую пробирку питательной среды, затем 70 микролитров ITS в 35 нанограммах на миллилитр, маркировку BDNF и заполните 35-миллиметровые стерильные чашки для культур примерно наполовину питательной средой L 15.

Используйте одну чашку для посева для каждого эмбриона, который вы препарировали. Чтобы изготовить гальваническую пипетку, возьмитесь за оба конца стеклянной пипетки и поместите коническую часть над пламенем. Затем раздвиньте концы примерно на 10 сантиметров.

Впоследствии отломайте конец, чтобы уступить до кончика примерно 0,2 миллиметра. После этого используйте пипетку для нанесения покрытий, чтобы отсосать кучу песка из одного эмбриона. Будьте осторожны, чтобы свести к минимуму количество набираемого раствора.

Затем выложите клетки на дно чашки для культивирования и разложите их на тарелки в несколько линий. Затем оставьте тарелки с пластинчатыми клетками в покое не менее чем на 15 минут, чтобы дать клеткам время прикрепиться к тарелке. После 12-24 часов в культуре пластинчатые клетки приобретают отчетливые морфологические характеристики.

Например, мышечные клетки приобретают веретенообразную форму, а спинномозговые нейроны развивают длительные процессы. Функциональный синаптический контакт между уратами, варикозным расширением вен и мышечными клетками может быть подтвержден с помощью одновременных парных электрофизиологических записей. Для этого подготовьте два патч-электрода для записи: один для пресинаптического варикоза, а другой для мышечной клетки.

Затем наполните пресинаптический электрод раствором, содержащим инфотерин, а постсинаптический электрод – внутренним раствором калия. После этого замените среду в чашке для культивирования на NFR. Затем перенесите его в инвертированный микроскоп, оснащенный контрастной оптикой для лица, заплатите пресинаптическое варикозное расширение с помощью электрода, содержащего амфотерицин, и постсинаптическую мышечную клетку с помощью другого электрода, чтобы подтвердить функциональность синапса, деполяризуйте варикозное расширение вен с помощью усилителя с патч-зажимом и наблюдайте за одновременными пресинаптическими и постсинаптическими токами.

На этом рисунке показано пятикратное представление клеток и культуры сразу после осаждения, и это та же самая культура при 40-кратной мощности. Вот нервно-мышечное соединение в культуре, которое показывает нейрональную сому, пресинаптическую клетку, варикозное расширение вен и постсинаптическую мышечную клетку. Здесь показаны пресинаптические и постсинаптические течения.

В ответ на применение 10-милливольтного шага инкрементального напряжения, представленного к пресинаптическому варикозному расширению от минус 30 милливольт до плюс 40 милливольт, удерживающий потенциал для обеих клеток составил минус 70 милливольт. Жизнеспособные клеточные культуры могут быть получены уже через 24 часа и могут сохраняться в течение нескольких дней. Этот препарат используется уже в течение нескольких лет, помогая объяснить некоторые фундаментальные свойства нервно-мышечной передачи.

Мы надеемся, что это видео позволит продолжить исследования, помогая исследователям лучше познакомиться с этим мощным и простым методом.