Экс внутриутробно электропорации и всего Экспланты полушарии: Простой экспериментальный метод исследования раннего развития коры

Общая цель данной процедуры заключается в подготовке эксплантатов целого полушария головного мозга для изучения раннего развития коры. Для этого сначала проводят забор эмбрионов мыши на 13-й эмбриональный день. Затем смесь плазмидной ДНК вводят в боковой желудочек мозга и выполняют электропорацию ex utero.

Затем из электропорированного эмбриона prepare эксплантат целого полушария. Заключительным этапом является фиксация и секционирование эксплантата целого полушария для гистологического анализа. В конечном итоге влияние мутации или воздействия токсина на развитие кортикальных нейронов можно оценить с помощью иммуногистологического анализа GFP-экспрессирующих нейронов.

Меня зовут Эрик Олсон. Я работаю на кафедре нейробиологии и физиологии в Медицинском университете SUNY Upstate в Сиракузах, и сегодня мы продемонстрируем вам разработанный нами метод, называемый эксплантацией всего полушария. Основным преимуществом этой техники по сравнению с существующими методами, такими как эксплантация срезов, является то, что эксплантаты всего полушария проще в подготовке и обеспечивают два дня органотипического роста.

Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейроразвития, например, каким образом конкретная мутация или токсин нарушают раннее развитие коры. Как правило, специалисты, впервые применяющие этот метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку подготовка эксплантата всего полушария без повреждения мозговых оболочек требует определенной практики. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы препарирования и переноса эксплантата сложно освоить из-за чувствительности ткани к механическим повреждениям.

Процедуру продемонстрирует доктор Тереза Оззи, постдок в моей лаборатории. Для данного протокола используйте коммерчески доступный набор для очистки плазмид. Приготовьте раствор плазмидной ДНК в воде с концентрацией 0.33 milligrams per milliliter и добавьте краситель fast green в качестве маркера инъекции в концентрации около 0.02%Weight by volume; всегда дезинфицируйте хирургические инструменты, рабочую зону и микроскоп.

Протрите 70% ethanol, затем усыпите необходимое количество самок Swiss Webster на 13-й день беременности (E 13) путем вдыхания углекислого газа. После извлечения эмбрионов поместите их в чашку Петри диаметром 10 см с ледяным HBSS, поддерживая чашку в охлажденном состоянии. Осторожно отделите каждый эмбрион от окружающих его внезародышевых оболочек.

Теперь перенесите каждый эмбрион по отдельности в чистую чашку с ледяным HBSS. С помощью шприца Hamilton введите от двух до трех микrolитров подготовленной ДНК в желудочек левого полушария головного мозга. Не проводите инъекцию в область коры или рядом с ней, предназначенную для последующего анализа.

Для электропорации ДНК осторожно удерживайте эмбрион пинцетом и слегка приложите положительный электрод-плоскость пинцета к дорсальной срединной линии головы. Отрицательный электрод-плоскость осторожно поместите под подбородок эмбриона. Запустите программу из пяти импульсов напряжением 30 вольт, длительностью 50 миллисекунд каждый с интервалами в одну секунду, используя прибор модели BTX 830; другие системы могут быть настроены в соответствии с инструкциями производителя.

Поместите каждый эмбрион обратно в охлажденный HBSS и приступайте к подготовке всего полушария мозга под диссекционным микроскопом, используя два пинцета ювелирных №5. Удалите кожу и хрящевой череп с головы эмбриона. Затем аккуратно просуньте пинцет под головной мозг.

Чтобы извлечь целый мозг из черепа, иссеките электропорированное полушарие, включая прилегающие ткани среднего мозга. Будьте осторожны, чтобы не повредить мозговые оболочки, покрывающие иссеченное кортикальное полушарие. По нашему опыту, самым сложным этапом, требующим освоения, является иссечение и удаление электропорированного полушария без повреждения мозговых оболочек.

После препарирования перенесите каждое полушарие в 5 mL ледяного HBSS, используя расширенный наконечник дозатора объемом 1 mL. При необходимости эмбрионы можно хранить в отдельных лунках 12-луночного планшета для культивирования тканей. Затем осторожно перенесите до шести полушарий на 24-мм культуральную поверхность, покрытую коллагеном.

Вставьте вставку медиальной стороной вниз. Наполните лунку диаметром 35 мм шестилуночного планшета 2,7 мл дополненной среды. Удалите излишки HBSS из вставки и поместите вставку в лунку со средой, затем с помощью пипетки нанесите несколько капель среды из лунки на поверхность каждого эксплантата.

Не увеличивайте объем среды. Мы обнаружили, что крайне важно нанести несколько капель культуральной среды на поверхность экспланта X таким образом, чтобы экспланты X не были полностью покрыты средой. Это может означать добавление до 400 µL к 2,7 мл среды поверх экспланта X.

Переместите чашку в камеру Биллапса-Ротенберга, содержащую увлажняющую чашку с водой и предварительно насыщенную 95% кислородом в течение как минимум одной минуты. Плотно закройте камеру и отсоедините трубку подачи газа. Поместите камеру в инкубатор при температуре 37 °C на два дня, к концу этого периода произойдет разделение препластов.

Подготовка. Изготовьте подушечки для заливки экспланта. Приготовьте 10% раствор желатина из телячьей кожи при температуре 60 °C.

После растворения налейте примерно 10 milliliters раствора в чашку диаметром 10 centimeter. Оставшийся раствор храните при температуре 60 degrees Celsius для последующего использования. При необходимости дайте подушечкам затвердеть в течение получаса.

Их можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких дней, однако перед использованием их необходимо довести до комнатной температуры. В день проведения фиксации в вытяжном шкафу приготовьте фиксатор Пагано и раствор Пагано без фиксатора. Подогрейте раствор для фиксации до 37 °C.

Осторожно и быстро извлеките эксплантаты из инкубатора, стараясь не повредить ткани. Удалите большую часть среды и замените ее пятью миллилитрами подогретого фиксатора. Убедитесь, что каждый эксплантат полностью погружен в жидкость.

Фиксируйте ткани в течение одного часа при комнатной температуре. Затем удалите фиксатор и замените его раствором Пагано. Без фиксатора.

Добавьте по несколько капель 10% азида натрия в каждую лунку. Теперь ткани можно хранить при температуре four degrees Celsius до их помещения на загрузочную подложку. С помощью линейки нарисуйте сетку на дне чашки.

Вырежьте квадраты размером два-три сантиметра. Перенесите отдельные экспланты на закрепляющую подложку. Пипеткой удалите остатки раствора и залейте каждый эксплант теплым 10% раствором желатина.

Дайте ему затвердеть. После медленного затвердевания постепенно добавляйте раствор желатина, пока каждый эксплант не будет полностью окружен. Избегайте расплавления подушечки, что может произойти при слишком быстром добавлении большого количества желатина.

Теперь дайте желатину затвердеть в течение примерно одного часа. После затвердевания отдельный эксплант можно разрезать на небольшие блоки желатина перед секционированием. Важно провести дофиксацию блоков в фиксаторе Пагано в течение одного или двух дней.

При создании срезов расположите эксплантаты обонятельной луковицей вверх и выполняйте разрезы в корональной плоскости с толщиной 100 µm. Собирайте срезы в охлажденный PBS с 0,1% азидом натрия.

Храните срезы при температуре 4 °C до момента их окрашивания по описанному методу. Эксплантаты целого полушария были подготовлены на стадии E 13 перед разделением пластин. В дорсальном неокортексе.

Ткань содержала трансген, который служит репортером незрелых нейронов возбуждающей кортикальной линии. Кортикальные эксплантаты из одного помета подвергались последовальной капельной фиксации в течение двух дней in vitro и обрабатывались для последующего гистологического анализа. В начальной временной точке анализа, DIV 0, расщепление препластов в поле один еще не произошло к DIV.

CP стал отчетливо виден и продолжал расти до стадии 2D IV. Таким образом, эксплантаты всего полушария, культивируемые изначально на стадии E 13, в течение двух дней поддерживали созревание коры головного мозга и зафиксировали предварительное разделение в дорсальном неокортексе, что подтверждает нормальное гистологическое развитие в дорсальном неокортексе. Эксплантаты 2D IV были иммуноокрашены на хондроитинсульфат, протеогликаны и компоненты внеклеточного матрикса. Две полосы иммунореактивности в дорсальной коре указывали на соответствующее разделение PPP на MZ и SP в период культивирования in vitro.

Препарат PP был разделен с помощью L на шесть кортикальных нейронов, экспрессирующих CTIP2 и TBR1. Характер иммуноокрашивания этих маркеров подтверждает соответствующую экспрессию данных факторов транскрипции в недавно сформированной cp. В совокупности эти анализы подтверждают ОРГАНОТИПИЧЕСКИЙ характер раннего развития коры во всем эксплантате полушария; с использованием всего описанного протокола была проведена инъекция в левый желудочек неповрежденных эмбрионов E13.

Экспрессия GFP в электропорированных и обработанных нейрональных предшественниках могла наблюдаться в vz. В то время как клетки с интенсивной экспрессией GFP наблюдались в IZ и cp, важно отметить, что многочисленные GFP-положительные нейроны, отмеченные наконечниками стрелок, наблюдались в верхней части формирующейся CP с появляющимися дендритами и аксонами. Дискретный слой на границе между CP и MZ указывает на правильную миграцию, остановку и ламинацию.

Дендриты распространялись в MZ, в то время как кортикофугальные аксоны простирались ниже CP и в iz. Дифференцирующиеся клетки представляли собой GFP-положительные клетки на разных стадиях зрелости, включая нейроны с биполярной морфологией, расположенные рядом с радиальными глиальными волокнами, и мультиполярные нейроны в iz ниже них. Дендриты также распространялись в MZ, где соответствующим образом иммунолокализован белок ЭЦМ reelin.

Таким образом, условия электропорации и культивирования экспланта обеспечивают нормальное развитие кортикальных нейронов. Как и ожидалось, постмитотические GFP-положительные нейроны заселили формирующуюся cp. Следовательно, данный протокол позволяет надежно таргетировать кортикальные нейроны L6 для изучения их миграции и созревания.

Широкое применение данной процедуры позволило достичь эффективности в 79%. Из 248 попыток 195 оказались пригодными для визуализации и анализа. Половина неудач была связана с отсутствием экспрессии GFP или пропуском целевого GFP после освоения метода.

При правильном выполнении эта методика занимает 90 минут. При проведении данной процедуры важно помнить о необходимости отработки навыков диссекции, чтобы после электропорации полушария можно было культивировать с сохранными мозговыми оболочками. Для получения ответов на дополнительные вопросы, например, о том, как исследуемые мутации нарушают миграцию нейронов или дендритогенез, можно использовать другие методы, такие как тайм-лапс микроскопия.