Графен Покрытия для биомедицинских имплантатов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать метод покрытия нитинола металлической формы из сплава памяти графеном для улучшения совместимости гемо в материалах имплантатов, контактирующих с кровью. Это достигается путем первого выращивания графена на медной фольге с использованием химического осаждения из газовой фазы. Вторым шагом является вытравливание медной фольги и перенос подготовленного графена на нитиноловые подложки.

Затем покрытые графеном нитинольные субстраты используются для культивирования эндотелиальных клеток и гладкомышечных клеток. Для количественной оценки цитосовместимости еще одним анализом является проверка совместимости с гемо путем кодирования обоих белков, фибриногена и альбумина на покрытых графеном нитинольных субстратах. В конечном счете, микрораминовая спектроскопия, конфокальная микроскопия in vitro анализы цитотоксичности и анализ белка страницы SDS используются для демонстрации успешного покрытия графена, улучшения морфологии клеток, улучшения жизнеспособности клеток и лучшей совместимости гемо.

Основное преимущество этого метода или существующих методов, таких как полимерное покрытие, заключается в том, что графеновые покрытия чрезвычайно долговечны и устойчивы к коррозии. Применение этого метода распространяется на улучшение происхождения технологий стентов, поскольку ожидается, что присущие графенам свойства материала снижают абсорбцию белка и уменьшают активацию факторов свертывания крови из-за подтверждающего изменения белка. Хотя этот метод может дать представление о графеновом покрытии, нитиноловые стенты также могут использоваться для других систем, таких как сердечные клапаны или катетеры.

Для начала поместите медную фольгу размером один сантиметр на один сантиметр в однодюймовую кварцевую трубчатую печь и нагрейте до 1000 градусов Цельсия в присутствии 50 SCC водорода и 450 SCC CM из Аргонна. Затем введите один и четыре SCCM метана в печь при температуре 1000 градусов Цельсия с разной скоростью потока на 20-30 минут. Охладите образцы до комнатной температуры внутри печи под воздействием водорода, аргонны и метана.

После извлечения образцов из печи разрежьте их на квадраты по 4,5 миллиметра и используйте ПММА, разбавленный 4%-ным анолисом, для отжима медной фольги при 4000 оборотах в минуту с последующей термической обработкой в течение пяти минут при 150 градусах Цельсия. Протравите медную фольгу с помощью травления CE 100 до полного протравливания медной фольги. Промойте в 10% соляной кислоте в течение 10 минут, затем в деионизированной воде в течение 10 минут.

Для получения образца графена ПММА перенесите образцы графена на подложки из нитинола размером 4,5 квадрата миллиметра. Далее при 450 градусах Цельсия в 300 SCCM аргона и 700 SCCM водорода в течение двух часов. Чтобы удалить ПММА, окончательно промойте нитиноловые подложки ацетоном, чтобы растворить остаточный ПММА и получить образец графена-никеля-титана.

Чтобы начать испытания на токсичность, добавьте нетронутый нитинол один или четыре субстрата из графена нитинола SCCM в 96 луночных планшетов, где указанный SCCM соответствует потоку метана, используемого при химическом осаждении графена из газовой фазы. Далее засейте эндотелиальные клетки аорты крысы по 10-5 клеток на лунку в некоторых лунках, содержащих нетронутый нитинол один или четыре SCCM. Субстраты из нитинола графена, гладкомышечные клетки аорты крысы аналогичным образом в различных колодцах.

Выращивайте клетки в течение трех или семи дней в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, обмениваясь средами через день. В конечный момент времени удалите среду из лунок, содержащих гладкомышечные клетки, и добавьте в каждую из них свежую среду, содержащую 0,5 миллиграмма на миллилитр МТТ. Хорошо инкубируйте клетки еще три часа.

Далее аккуратно удалите среду и добавьте в каждую лунку по 100 микролитров диметилсульфоксида. Подождая 10 минут, чтобы кристаллы МТТ растворились, переложите раствор в другую луночную пластину. Для анализа MTS следует удалить среду из лунок, содержащих эндотелиальные клетки, в конечный момент времени.

Замените на 120 микролитров раствор МТС и выдержите в течение трех часов. Затем переложите содержимое лунки на новую пластину. Считайте абсорбент на 490 нанометрах и определите процент жизнеспособности, нормализовав поглощение до среднего уровня поглощения первозданного образца нитинола.

Повторите этот шаг не менее пяти раз для каждого образца. Для конфокальной визуализации гладкомышечных клеток аорты крысы поместите субстраты в предметное стекло с восемью камерами, оставив одну камеру пустой в качестве контроля. Затем засейте клетки во всех камерах по 25 000 клеток в каждой камере и инкубируйте в течение трех дней при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

После снятия среды со стекол приклейте клетки на подложку с 4%-ным формальдегидом в PBS-буфере на 20 минут. Умойтесь PBS, затем проведите перманентно с 0,1% Triton X в течение одной минуты. После промывки PBS добавьте 100 микролитров раствора LOR 4 88 PHIN в 1,9 миллилитра буфера PBS.

Для визуализации актона окрашивают клетки 250 микролитрами LOR 4 88 Phin в течение 45 минут, а затем дважды промывают PBS буфером. Далее окрашиваем ядра флуоресцентной монтажной средой, содержащей dpi. Собирайте конфокальные изображения с помощью конфокального принтера Nikon.

Прежде чем начать эксперименты по усвоению альбумина и белка фибриногена, измерьте размеры субстрата с помощью штангенциркуля. Сделайте по три измерения для каждой стороны примерно квадратных образцов и усредните. Чтобы получить длину и ширину, поместите первозданный образец нитинола, один образец SCCM Graphene Nitinol и четыре образца SCCM Graphene Nitinol в два 12.

В луночные планшеты добавляют PBS буфер, содержащий один миллиграмм на миллилитр альбумина. Добавьте комнатную температуру в одну из тарелок и выдерживайте три часа отдельно. Инкубируйте три типа образцов с PBS-буфером, содержащим один миллиграмм на миллилитр.

Фибриноген при комнатной температуре в течение трех часов после промывки образцов PBS соединить аналогичные образцы в микроцентрифужной пробирке с 200 микролитрами буфера редуцирующего образца и кипятить в течение пяти минут. Разбавьте образцы в соотношении от одного к девяти объему буфера T glycine SDS к деионизированной воде и пропустите через 4-15% трис-полиакриламидный гель для электрофореза при напряжении 90 вольт в течение 100 минут. Разведите красный стоковый раствор spro в соотношении один к 5 000 в 7,5% уксусной кислоте.

Далее окрашиваем гели на 60 минут разведенным раствором spro red. Оберните в алюминиевую фольгу, чтобы защитить spro red от светлого изображения гелей с помощью Fluor chem SP и количественно оцените интенсивность флуоресценции с помощью программного обеспечения Image J. Затем нормализуйте интенсивность флуоресценции из каждого образца по общей площади субстрата и сравните абсорбцию фибриногена с абсорбцией альбумина.

Методом химического осаждения из газовой фазы были получены образцы поликристаллического графена, которые имитируют зерна кристаллов меди Спектроскопия рамена была использована для подтверждения наличия монослойного графена на одном и четырех образцах SCCM. Один образец SCCM демонстрирует интенсивную полосу георадара, указывающую на монослойную природу полученного графена. Напротив, образец из четырех SCCM показывает относительно более слабую полосу георадара, что подтверждает наличие нескольких слоев графена.

Детальные измерения образца дали значение шероховатости поверхности примерно в пять нанометров. Показывать. Вот изображения конфокальной оптической микроскопии гладких мышечных клеток, выращенных на контролируемом предметном стекле на нетронутых нитинольных подложках на одной подложке из графена и нитинола SCCM и на четырех подложках из графена и нитинола SCCM. Клетки плотные и сферические на обеих поверхностях графен-нитинола, что демонстрирует лучшую морфологию клеток.

Анализы MTT и MTS показывают, что один и четыре субстрата SCCM графена нитинола не демонстрируют существенной разницы в жизнеспособности гладкомышечных клеток по сравнению с нетронутым нитинолом. Анализы MTS показывают, что трехдневная жизнеспособность эндотелиальных клеток существенно не отличалась от контрольной группы. Изображения сканирующей электронной микроскопии показывают, что эндотелиальные клетки, выращенные на нетронутых нитинольных субстратах, разрежены и вытянуты, в то время как на одной и четырех графеновых нитинольных субстратах SCCM они эллипсоидальные и плотные.

Эти результаты демонстрируют, что графеновые покрытия приводят к лучшей сферической клеточной морфологии эндотелиальных клеток, один образец SCCM и четыре образца нитинола графена SCCM демонстрируют низкое соотношение фибриноген альбумина по сравнению с образцом нетронутого нитинола, что свидетельствует о лучшей совместимости гемо, возникающей благодаря графену. Уравновешивание уровня Ферми показано диаграммой энергетического уровня для фибриногена и плотности электронных состояний для графена. Перенос электронов от фибриногена к нитинолу графена возможен только из занятых электронных состояний молекулы фибриногена в пустые электронные состояния нитинола графена на том же энергетическом уровне.

Как моно, так и малослойный графен являются полуметаллами при комнатной температуре с низкой электронной плотностью на уровне ярости, что приводит к слабому переносу заряда от фибриногена к графену. Графен не проявляет никаких изменений в форме или частоте полосы GB, что указывает на слабый перенос заряда от белков плазмы. Изогнутые D-образные пики, полученные в результате подгонки кривой, показаны черным цветом, чтобы продемонстрировать полезность и жизнеспособность графена в качестве покрытия имплантата.

Медный пенни, покрытый графеном, подвергался воздействию 5% перекиси водорода. Покрытая графеном часть пенни осталась неизменной, в то время как непокрытая часть была обесцвечена раствором перекиси водорода. Кроме того, нитинол графена, погруженный в 70% азотной кислоты, не показал изменений в частоте полосы GB, что подтверждает, что графеновое покрытие чрезвычайно долговечно.

Кроме того, графеновое покрытие в нитиноле графена восстанавливается до скорости X нижележащей меди, что указывает на непроницаемость графеновых мембран. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как переносить графеновые и биомедицинские имплантаты для улучшения их биосовместимости.