Изображений в реальном времени из гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействий на активированного эндотелия Во сосудистого воспаления и тромбообразования в живых мышей

Здесь мы сообщаем экспериментальная методика прижизненной флуоресцентной микроскопии для визуализации гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействия на активированном эндотелии во сосудистыми воспаление и образование тромба в живых мышей. Это микроскопические технология будет ценным для изучения молекулярных механизмов сосудистых заболеваний и для проверки фармакологических агентов по патофизиологических условиях.

Общая цель данного эксперимента — визуализировать типичное взаимодействие между тромбоцитами и нейтрофилами на активированном эндотелии при сосудистых заболеваниях. Это достигается с помощью флуоресцентной внутривитальной микроскопии в реальном времени у живых мышей для визуализации микроциркуляторного русла в кремастерной мышце. На втором этапе вводятся флуоресцентно меченые антитела и инициируется воспаление или повреждение улицы, что способствует прямой визуализации результирующих типичных взаимодействий тромбоцитарных нейтрофилов.

Далее сохраненные данные анализируются с целью количественной оценки количества ячеек и их динамики. В конечном счете, прямые типические взаимодействия между тромбоцитами и нейтрофилами на активированном эндотелии могут быть оценены на основе флуоресцентного сигнала введенных антител в прижизненной микроскопии в реальном времени. Наш прижизненный микроскопический метод может дать представление о взаимодействиях между тромбоцитами и нейтрофилами на активированном эндотелии в режиме реального времени во время сосудистого воспаления и образования тромбов.

Эта технология также может быть применена к другим системам, таким как оценка взаимодействия раковых клеток и клеток крови. Перед началом эксперимента включите систему микроскопа для модели сосудистого воспаления. Внутрирычащий впрыск зеркального TNF альфа за три часа до IP-инъекции анестетиков.

После того, как седативный эффект был подтвержден щипцом ноги, канюльную трубку PE 90 в трахею мыши, чтобы устранить любые трудности с дыханием. Затем канюльно ввели трубку PE 10 в левую яремную вену для инфузии флуоресцентно меченных антител и дополнительных анестетиков. Затем аккуратно вытяните и горизонтально пронзите кожу мошонки и нанесите предварительно согретый буфер на операционное поле.

Теперь надавливая на низ живота одним щипцом, осторожно вытащите яичко другим по размеру щипцом, освойте мышцу автомобиля вертикально и расплющите мышцу над стеклянной крышкой, наденьте на лоток для внутрифлаконного микроскопа, прижав периферическую ткань к лотку. Начните этот шаг с введения DITE 4 88 конъюгированных крысиных антител, антимышиных CD 42 C и Alexa floor 6 47 конъюгированных антител против мышиного GR one через ранее установленную яремную канюлю. Затем в наборе фильтров микроскопа отметьте галочками каналы, которые будут экспонироваться, и установите время экспозиции для каждого выбранного интервального захвата.

Установить количество временных точек от 1000 до 1500 с интервалом 200 миллисекунд для общего затраченного времени в пять минут. После того, как все параметры были заданы при захвате изображения, выберите «Начать», чтобы начать захват при 60-кратном увеличении с окном 157 микрометров на 118 микрометров. Наблюдайте за правящими и адгезивными тромбоцитами в нейтрофилах в течение пяти минут в верхней половине воспаленного кремастера.

Чтобы проанализировать тромбообразование тромбов тромбоцитов, перейдите в раздел Маска и выберите кнопку Создать. Затем под инструментом «Область» на главном виде нажмите на большой значок карандаша. С помощью карандаша раскрасьте область за пределами судна на основном виде.

Чтобы задать маску фона, перейдите к маске, нажмите копировать эту плоскость, нажмите копировать маску. В текущей временной точке выберите все временные точки и нажмите OK. Чтобы рассчитать фоновый сигнал, перейдите в статистику и нажмите маскировать статистику.

Затем в области изображения нажмите «Текущая 2D-таймлапс» или «Четыре D-изображения» в области маски, выберите всю маску в функциях. В поле Дата захвата выберите затраченное время. В разделе Геометрия морфа выберите область в пикселях, а в разделе Интенсивность выберите максимальную интенсивность.

Теперь нажмите «Экспорт». Откройте текстовый файл в программе для работы с электронными таблицами и рассчитайте среднее значение фонового сигнала за весь период записи. Для определения интенсивности фоновой флуоресценции.

После вычисления интенсивности фоновой флуоресценции во время тромба тромбоцитов, как только что показано в модели воспаления печени, перейдите к маске, щелкните сегмент, выберите подходящий e и канал, а затем вставьте среднее значение фонового сигнала при низком уровне нажмите apply и ok. Затем перейдите в статистику и нажмите маскировать статистику. Теперь в области изображения нажмите на текущую 2D-покадровую съемку или четыре D-изображения в области маски, выберите всю маску в функциях в разделе Дата захвата, выберите прошедшее время в разделе Морф-геометрия, выберите область в пикселях и в разделе Интенсивность, выберите некоторую интенсивность.

Затем нажмите «Экспорт». Откройте текстовый файл в программе для работы с электронными таблицами и рассчитайте интенсивность флуоресценции тромба тромбоцитов. Для анализа артериального тромбоза начните с введения DITE 4 88 конъюгированных антител против мыши CD 42 C ANDOR 6 47 конъюгированных антител против мышиного GR one, как только что было показано.

После нажатия кнопки «Старт» для начала процесса захвата изображения дважды щелкните по пятну в двух-трех микрометрах от стенки сосуда, чтобы запустить лазер. Повреждение эндотелиальных клеток артериол вызывает визуальное изменение формы, которое должно быть видно на ярком изображении поля, с последующим накоплением тромбоцитов. Через пять минут после лазерной травмы сделайте паузу и отмените захват.

Затем начните захват с 2 400 временных точек с интервалом 500 миллисекунд для регистрации адгезивных тромбоцитов и катящихся и адгезивных нейтрофилов в течение 20 минут. Рассчитав интенсивность фоновой флуоресценции во время тромба тромбоцитов аналогично модели воспаления печени, перейдите к маске, кликните по сегменту, выберите фит и канал и вставьте среднее значение фонового сигнала при низком клике, примените и окей. Теперь в области изображения нажмите Current 2D time-lapse или 40D images в области маски, выберите всю маску в функциях под датой захвата, выберите прошедшее время в разделе Morpho выберите область в пикселях и в разделе интенсивность выберите некоторую интенсивность.

Затем нажмите «Экспорт». Откройте текстовый файл в программе для работы с электронными таблицами и рассчитайте интенсивность флуоресценции тромба тромбоцитов. Чтобы количественно определить вращающиеся и адгезивные нейтрофилы, воспроизведите таймлапс и подсчитайте количество клеток, которые заметно переворачиваются.

Перекатывание тромбоцитарного тромба в течение 20 минут определяется как снижение скорости нейтрофилов при взаимодействии с тромбом тромбоцитов в течение не менее двух секунд. Адгезивные нейтрофилы определяются как любые нейтрофилы, которые остаются прикрепленными к тромбу тромбоцитов в течение как минимум двух минут. Здесь репрезентативны изображения появления флуоресцентных сигналов, связанных с нейтрофилами в красном цвете и тромбоцитами в зеленом.

Во время воспаления глаз стрелкой показано направление кровотока в сосуде. Количество катящихся и адгезивных нейтрофилов на воспаленных эндотелиальных клетках определено как 0,25 клеток в минуту и 18,5 клеток в пять минут соответственно. Данные являются репрезентативными для среднего значения плюс-минус стандартная ошибка среднего значения 30 различных E у четырех мышей дикого типа.

Здесь построен график медианы интегрированного флуоресцентного сигнала тромбоцитов в зависимости от времени. Было обнаружено, что большинство тромбоцитов красного цвета прилипают к адгезивным и ползущим нейтрофилам зеленого цвета, а не к воспаленной стенке сосуда. Теперь перейдем к взаимодействию нейтрофильных тромбоцитов после лазерно-индуцированного повреждения артериол.

Эти изображения иллюстрируют один нейтрофил красным цветом и обозначен желтой стрелкой, скользящей по тромбу тромбоцита зеленым цветом, второй нейтрофил красным цветом и обозначен белой стрелкой, быстро скользящей по эндотелиальным клеткам артериол, оба в течение пятисекундного интервала захвата здесь показаны одним нейтрофилом, снова красным цветом, перекатывающимся и прилипающим к тромбу тромба тромба зеленого цвета в течение 15-секундного интервала. Наконечник стрелки идентифицирует катящиеся и прилипшие нейтрофилы, а толстая серая стрелка указывает направление кровотока. Здесь построен график медианы интегрированного флуоресцентного сигнала тромбоцитов в зависимости от времени.

Количество катящихся и адгезивных нейтрофилов было определено как 21,5 и 1,6 клеток за 20 минут соответственно. Первоначальное быстрое скручивание нейтрофилов происходило на эндотелиальных клетках. Как только нейтрофилы контактировали с тромбом тромбоцитов, скорость вращения нейтрофилов на тромбоцитарном тромбе изменялась с диапазоном 8,2 микрометра в секунду и опосредовалась взаимодействием пектина и psgl L.

Данные представляют собой среднее значение плюс-минус, стандартную ошибку среднего значения 14 различных тромбов у семи мышей дикого типа через пять минут после лазерного повреждения. Размер тромба тромбоцита остается относительно постоянным во время визуализации, а нейтрофилы накатываются на тромб и прилипают к нему. Флуоресцентный сигнал от циркулирующих тромбоцитов незначителен.

По сравнению с тромбом тромбоцитов, после просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как настроить прижизненную систему микроскопа с живыми мышами, позволяющую визуализировать в режиме реального времени гетеротипические взаимодействия между тромбоцитами и нейтрофилами на активированном эндотелии в микроциркуляторном русле