Роман Экс естественных Культура Метод эмбриональном сердце мыши

Общей целью этой процедуры является иссечение сердца эмбриона для культивирования ex vivo. Это достигается путем извлечения маточного рога у беременной самки мыши. Затем эмбрион извлекается и подготавливается к вскрытию.

Затем грудная стенка эмбриона вскрывается для визуализации сердца. Наконец, сердце вырезают и помещают в культуру, содержащую разведенный матригель. В конечном счете, можно получить результаты, которые покажут здоровое живое сердце при наблюдении под ярко-польным микроскопом.

Основное преимущество этой методики по сравнению с другими методами, такими как качание культур, заключается в том, что сердце можно лечить либо местными агентами, такими как белок, конъюгированный с бусиной, либо глобальными агентами, такими как добавление небольшой молекулы в матригель. Применение этого метода распространяется на терапию сердечно-сосудистых заболеваний, поскольку он позволяет исследовать события в специализированных сегментах сердца в контексте всего интактного органа. После усыпления беременной мыши в желаемый эмбриональный день, используя технику, одобренную вашим институтом, обильно распылите на самку 70% этанола перед вскрытием брюшной полости и извлечением и иссечением маточного рога.

Поместите маточный рог в чашку Петри, содержащую холодный XPBS, и промойте ее. Поставьте блюдо на лед до готовности к препарированию. Затем разрежьте маточный рог по средней линии, чтобы обнажить прикрепленные эмбриональные мешки.

Разрежьте мешок с эмбрионом и поместите эмбрион во вторую чашку Петри с холодным PBS. Поставьте блюдо с маточным рожком на лед. Обезглавив эмбрион, поместите эмбрион на его спину и разрежьте.

Откройте стенку грудной клетки, чтобы визуализировать сердце и легкие. В зависимости от сцены, стенка грудной клетки может быть прозрачной. Если необходимо провести генотипирование, сохраните хвост эмбриона.

С помощью щипцов аккуратно приподнимают сердце и разрезают сосуды ниже. Затем разрежьте над большими сосудами, чтобы освободить сердце. При необходимости удалите посторонние ткани.

Поместите сердце в одну лунку из 24-луночной тарелки, наполненной холодным PBS, и посадите на лед. Повторите вскрытие, чтобы изолировать все сердца эмбрионов. В колпаке с ламинарным потоком смешайте холодный гель matri и желаемую питательную среду в соотношении один к одному, сохраняя разбавленный гель matri на льду.

Пипеткой внесите от 500 до 1000 микролитров раствора в лунки 24 лунки культуры. Подавайте это со льдом. Осторожно соберите и поместите вырезанные сердечки в отдельные лунки чашки для культур, содержащей культуру.

Если ориентация встроенного сердца имеет решающее значение, используйте 70% этанол для обильного распыления на перевернутый микроскоп и окружающее пространство. Затем после работы в капюшоне поместить сердечко в лунку коврика с гелем на льду. Поместите пластину на предметный столик для микроскопа и быстро сориентируйте сердце, когда гель начнет затвердевать.

Поместите чашку для культивирования во влажный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и дайте гелю застыть в течение примерно 30 минут. Добавьте один миллилитр предварительно подогретой культуры, среднюю в каждую лунку, содержащую сердце. Сердца могут оставаться в культуре не менее четырех дней.

При желании добавьте флуоресцентный кристалл для живых клеток, например, cyto 16. Для визуализации живого сердца фотография будет ограничена той стороной сердца, которая видна в зависимости от положения, в которое оно было встроено. Если будет выполняться визуализация всего монта или секционирование, удалите питательную среду.

Замените его холодным 4%-ным формальдегидом, и поставьте блюдо на лед на 30 минут. После того, как матригель растворится, замените фиксатор и матригель свежим формальдегидом и зафиксируйте сердца на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Промойте сердечки PBS или Triss и храните при температуре четыре градуса Цельсия до дальнейших анализов.

При культивировании ex vivo в течение 24 часов коронарная сосудистая сеть выглядит похожей на сердце, вырезанное из эмбриона сопоставимого возраста, который сохранялся внутриутробно, как показано здесь. Анализ гемата, тоина и эоина сердца, иссеченного при Е 16,5 и культивируемого ex vivo в течение четырех дней, показывает, что общая морфология, включая стенки магистральных артерий и миокард межжелудочковой и межжелудочковой перегородки сердца, остается нетронутой, несмотря на отсутствие кровообращения. Коронарные остео заметны, на что указывает наконечник стрелы.

Тем не менее, фрагментация ДНК, обозначенная стрелками и наблюдаемая как h, так и d и DAPI, очевидна в компактном миокарде и вокруг крупных сосудов. Кроме того, миокард менее плотный по сравнению с сердцем из эмбриона Е 18,5, который развился внутриутробно, несмотря на то, что культивированное ex vivo сердце все еще билось. Таким образом, существуют ограничения на продолжительность времени или стадию, на которой эти сердца могут поддерживаться.

Этот метод культивирования также может быть использован для флуоресцентного мечения сердец, в то время как в культуре после инкубации с эндотелиальным специфическим флуоресцентным красителем сердца культивируются в течение 48 часов. В этом случае визуализация ограничена в зависимости от ориентации сердца и помутнения ткани. Последующие гистологические срезы через миокард желудочков подтверждают, что цито 16 может проникать через внешние клеточные слои для маркировки субэпикардиальных сосудов в желудочках и локализоваться с помощью селектина, как показано здесь После культивирования ex vivo в течение 30 часов сердце, вырезанное из эмбриона Е 14,5, демонстрирует постоянную сократительную способность и ритм между предсердиями и желудочками.

При выполнении этой техники важно быть нежным и осторожным при иссечении сердца. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как иссекать и культивировать эмбриональное сердце мыши.