Роман с высоким разрешением В естественных условиях Изображений методика исследования динамических характеристик внутричерепных структур к росту опухоли и терапии

Общая цель этой процедуры заключается в получении изображений одиночных клеток костного мозга с высоким разрешением, отслеживая их паттерны рекрутирования в нормальный мозг и сосудистую сеть, связанную с опухолью головного мозга с течением времени. Это достигается путем удаления большеберцовой и бедренной костей у мышей-доноров для получения флуоресцентных клеток-предшественников костного мозга, а затем введения этих клеток облученным мышам-реципиентам. Вторым шагом является получение внутричерепных ксенотрансплантатов GB M у химерных мышей внутри черепно-оконной камеры.

Затем мыши проходят различные режимы лечения, включая стереотаксическое управляемое излучение. Последним шагом является получение изображения мышей на двухфотонном конфокальном микроскопе. В конечном счете, данная методология может быть использована для динамического изучения механизмов внутричерепной васкуляризации в различных моделях.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как гистопатология тканей ex vivo, заключается в том, что мы можем изучать критическую динамическую информацию, связанную с формированием сосудов в головном мозге. Таким образом, мы можем ответить на ключевые вопросы, связанные с механизмами межчерепной неоваскуляризации. Хотя этот метод может быть использован для получения информации о внутричерепной неоваскуляризации, он также может быть применен к другим системам и патологическим процессам в мозге, таким как внутричерепная ишемия или инсульт, нейродегенеративные заболевания и механизмы метастазирования опухолевых клеток в мозг.

Для целей этого видео мы не смогли соблюсти строгую технику асептики. Таким образом, биозащитный капюшон представляет собой отверстие более чем на 12 дюймов, и животные не драпируются, что позволяет зрителю получить более четкое изображение и лучший доступ для ориентации процедур для экспериментальной работы. Следует строго соблюдать асептическую технику.

Начните эту процедуру с подтверждения экспрессии флуоресценции у донорской мыши GFP и усыпьте ее в соответствии с рекомендациями комитета по уходу за животными в учреждении. Затем очистите обе задние конечности и удалите большеберцовую и бедренную кости во время работы в асептических условиях. Удалите всю лишнюю ткань с костей.

Затем снимите торцевые пластины с обоих концов четырех извлеченных костей. Промойте их иглой 22 калибра и одним миллилитром стерильного PBS. Они станут прозрачными, как только весь костный мозг будет промыт.

После этого смешайте извлеченную суспензию костного мозга. Ну, он должен содержать примерно 20 миллионов клеток, чего достаточно для восстановления трех мышей-хозяев. Далее подготовьте 3 иглы туберкулина 27 калибра и наберите в каждую из них по 300 микролитров суспензии костного мозга.

Пока мышь находится в ограничителе. Отметьте спинную поверхность хвоста, чтобы сориентироваться. Затем вводят суспензию в боковую хвостовую вену трех ранее облученных вен.

Нод скользит мышей при этой процедуре при работе в асептических условиях. Обезболите химерный костный мозг мышей и введите упреждающую анальгезию, одобренную IACUC. Нанесите слезоточивый гель для предотвращения обезвоживания роговицы.

Очистите голову сначала раствором бетадина, затем спиртом и удалите лишние волосы. Затем дополнительно очистите подлежащую кожу головы спиртом. Сделайте разрез от середины ушей до чуть выше глаз.

Удалите скальп по обе стороны от первого разреза, чтобы обнажить около пяти миллиметров подлежащего черепа. Затем определите анатомические ориентиры поверхности черепа. Затем определите и подтяните надкостницу путем введения 2% лидокаина с раствором адреналина.

Впоследствии рассеките надкостницу в сторону от поверхности черепа острым инструментом. Затем используйте 2,7-миллиметровое сверло для уточнения TR, чтобы ослабить 2,7-миллиметровый круглый костный лоскут на правой полусфере черепа, равноудаленный как от лямбда, так и от bgma. Не проникайте в кость бормашиной, чтобы защитить подлежащую твердую мозговую оболочку и ткани.

Теперь удалите ослабленный костный лоскут с помощью диссекции, пинцета и зубного крючка с преднамеренной, но контролируемой силой. Далее загрузите шприц Гамильтона 30 калибра 10 микролитрами клеточной суспензии и поместите иглу на стереотаксическую рамку. Затем поместите мышь на стереотаксическую рамку.

Выровняйте иглу по центральной точке образовавшегося после этого окна, опустите иглу до тех пор, пока она не коснется поверхности коры. Затем сбросьте цифровые координаты. Теперь опустите иглу на 3,2 миллиметра в кортикальную ткань.

Затем втяните 0,2 миллиметра и введите на три миллиметра. Глубинный впрыск должен осуществляться из расчета 10 микролитров в минуту. Когда инъекция будет завершена, оставьте иглу на месте на одну минуту, прежде чем медленно втянуть ее.

Затем извлеките мышку из рамки. Впоследствии поддерживайте поверхность мозга увлажненной. Использование капель стерильного PBS.

Поместите трехмиллиметровую защитную крышку на поверхность мозга, чтобы закрыть 2,7-миллиметровое окно. Затем просушите окружающую кость черепа. Затем нанесите ветеринарный бонд, чтобы приклеить ткань кожи головы к кости черепа и удерживать чехол на месте.

Не наносите слишком много, так как это приведет к утечке под стекло и снижению потенциала изображения. Затем смешайте свежий стоматологический акриловый порошок и раствор в капюшоне и нанесите смесь на ветеринарный бонд с помощью иглы 22 калибра. Чтобы обеспечить плотное прилегание, наносите акрил так, чтобы он слегка перекрывался краем стеклозащитного стекла, но не закрывал стеклозащитное стекло.

На этом этапе поместите мышь под наркозом в специальный ограничитель для головы внутри стереотаксического облучателя XAD 2 25, разработанного в доме. Получите компьютерную томографию с углом обзора 360 градусов с помощью рентгеновской трубки, работающей при пиковом напряжении 40 килоампер и 0,05 миллиампер через двухмиллиметровый алюминиевый фильтр. Используйте изображение, чтобы расположить предметный столик таким образом, чтобы центр излучения ISO был направлен в правое полушарие и находился в центре в дорсальном вентральном направлении.

Для наведения на излучение доступно большое разнообразие коллиматоров, что демонстрирует адаптивность модели. В данном случае мы используем для облучения полушария размером восемь на 11 миллиметров. Вставьте полусферический коллиматор в стереотаксический облучатель X RAD 2 25.

Получайте ортогональные изображения одиночной компьютерной томографии сверху и снизу через коллиматор, чтобы обеспечить правильное положение головы за счет определения анатомических костных структур и ручной точной настройки положения сцены на мониторе. Замените алюминиевый фильтр XAD 2 25 IRRADIATOR на медный фильтр толщиной 0,93 мм. Затем запустите программу рентгеновской трубки при пиковом напряжении 225 и 13 миллиамперах и подайте половину дозы облучения сверху в направлении AP.

Верните портал в нижнее положение и введите вторую половину дозы облучения снизу в направлении ПА. При этой процедуре обезболивают ранее сгенерированную внутричерепную оконную мышь и очищают окно с помощью спиртового спрея. Настройте каналы на конфокальном микроскопе в соответствии с флюорохромами, интегрированными в сгенерированную химерную мышь.

В качестве альтернативы можно повторно использовать предыдущие настройки, чтобы уменьшить вариативность между сеансами визуализации. Введите любые метки, необходимые для визуализации, в этом случае в боковую хвостовую вену, дексон для сосудистой системы. Переверните мышь на специально изготовленный ограничитель головы, поддерживаемый формованным пластилином, убедившись, что головка перпендикулярна лазеру, и установите ограничитель на подвижный предметный столик микроскопа.

Включите первый канал лазера и расположите его к центру внутричерепного окна, глядя прямо на точку пересечения лазерного луча на окне камеры. Возьмите изображение каждого канала для всего окна с помощью пятикратного объектива и используйте его в качестве карты для других изображений с более высоким разрешением с 10-кратным и 20-кратным объективами дальнего действия. На этой схеме показаны технические ошибки, связанные с хирургическим процессом, и показано, какое влияние каждая из них окажет на получаемые изображения.

Попавший воздух под окном будет виден в виде пузырей на изображениях. Акриловые отложения на стекле являются автофлуоресцентными в дальнем красном канале и блокируют часть поля зрения. Точно так же грязь на окне во время съемки отображается на изображениях как автофлуоресцентная изгиб

Даже идеальное внутричерепное окно может столкнуться с проблемами, как только оно окажется под микроскопом. Дышащие артефакты приводят к выравниванию изображений, в то время как плохое расположение мыши в кадре приводит к сегментированному изображению. Поскольку лазер проникает только через часть ткани с последующей обработкой изображения, можно добавить дополнительный канал для помеченных CFP клеток, с помощью которого изображения GFP могут быть вычтены из изображений CFP для выявления истинного сигнала CFP.

Кроме того, используя автофлуоресценцию второго гармонического поколения, характерную для четырех волокон коллагена, мы можем визуализировать базальную мембрану сосудистой сети. Наличие пяти флуоресцентных каналов обеспечивает пользователю большую гибкость и адаптивность новой модели зеркального отражения, описанной в данной статье. При попытке проведения этой процедуры важно помнить об опасных продуктах, используемых во время хирургических процедур.

Также важно быть скрупулезным и уделять особое внимание деталям, чтобы гарантировать, что мозговая ткань останется неповрежденной на протяжении всей долгосрочной визуализации. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как создать химерную мышь с флуоресцентными клетками-предшественниками, и, в свою очередь, иметь возможность получать изображения внутричерепной сосудистой сети с высоким разрешением в режиме реального времени после имплантации опухолевых клеток с терапевтическим вмешательством или без него.