Роман с высоким разрешением

Общая цель данной процедуры — получение изображений отдельных клеток предшественников костного мозга с высоким разрешением для изучения закономерностей их рекрутирования в сосуды нормального мозга и сосуды, ассоциированные с опухолью мозга, в динамике. Это достигается путем извлечения большеберцовой и бедренной костей донорских мышей для получения флуоресцентных клеток-предшественников костного мозга с последующим введением этих клеток облученным мышам-реципиентам. На втором этапе в этих химерных мышах создаются внутричерепные ксенографты ГБМ в камере краниального окна.

Затем мыши подвергаются различным режимам лечения, включая стереотаксическое облучение. Заключительным этапом является визуализация мышей с помощью двухфотонного конфокального микроскопа. В конечном счете данная методика может быть использована для динамического изучения механизмов внутричерепной васкуляризации в различных моделях.

Основное преимущество этого метода перед существующими подходами, такими как гистопатология тканей ex vivo, заключается в возможности изучения критически важной динамической информации, связанной с формированием сосудов в головном мозге. Таким образом, мы можем ответить на ключевые вопросы, касающиеся механизмов внутричерепной неоваскуляризации. Хотя данный метод может быть использован для получения сведений о внутричерепной неоваскуляризации, он также применим к другим системам и патологическим процессам в мозге, таким как внутричерепная ишемия или инсульт, нейродегенеративные заболевания и механизмы метастазирования опухолевых клеток в головной мозг.

Для целей данной видеозаписи мы не могли строго соблюдать правила асептики. В связи с этим отверстие бокса биологической безопасности превышает 12 дюймов, а животные не покрыты стерильными салфетками, что обеспечивает более четкое изображение и лучший обзор для понимания хода процедур при проведении экспериментальной работы. В реальных условиях необходимо строго соблюдать правила асептики.

Начните выполнение данной процедуры с подтверждения флуоресцентной экспрессии у мыши-донора GFP, затем проведите эвтаназию животного в соответствии с рекомендациями институционального комитета по уходу за животными. Затем в асептических условиях очистите обе задние конечности и извлеките большеберцовую и бедренную кости. Удалите все излишки мягких тканей с костей.

Затем снимите торцевые пластины с обоих концов четырех извлеченных костей. Промойте их с помощью иглы 22-го калибра и одним миллилитром стерильного PBS. Кости станут прозрачными, когда весь костный мозг будет вымыт.

После этого перемешайте полученную суспензию костного мозга. В ней должно содержаться примерно 20 миллионов клеток, чего достаточно для восстановления трех мышей-реципиентов. Затем подготовьте 3 туберкулиновые иглы 27-го калибра и наберите в каждую из них по 300 µL суспензии костного мозга.

Пока мышь находится в фиксаторе, отметьте дорсальную поверхность хвоста для ориентира. Затем введите суспензию в латеральную хвостовую вену трех предварительно облученных мышей.

В данной процедуре используются мыши линии Nod skid в асептических условиях. Проведите анестезию химерных мышей Nod skid с пересаженным костным мозгом и введите превентивные анальгетики, одобренные комитетом IACUC. Нанесите гель для глаз, чтобы предотвратить дегидратацию роговицы.

Сначала обработайте голову раствором Бетадина, затем спиртом и удалите излишки волос. После этого дополнительно очистите кожу головы спиртом. Сделайте разрез от середины ушей до области чуть выше глаз.

Удалите кожу с обеих сторон первого разреза, чтобы обнажить примерно пять миллиметров подлежащей кости черепа. Затем определите анатомические ориентиры на поверхности черепа. После этого идентифицируйте и отслоите надкостницу, вводя 2% раствор лидокаина с эпинефрином.

Затем с помощью острого инструмента отделите надкостницу от поверхности черепа. После этого используйте прецизионный бор TR диаметром 2.7 millimeter, чтобы истончить кость для создания круглого костного лоскута диаметром 2.7 millimeter в правом полушарии черепа на равном расстоянии от Lambda и bgma. Не просверливайте кость насквозь, чтобы не повредить подлежащую твердую мозговую оболочку и ткани.

Теперь аккуратно, но с контролируемым усилием удалите ослабленный костный лоскут, используя диссектор, пинцет и стоматологический крючок. Затем наберите в шприц Hamilton 30-го калибра 10 µL клеточной суспензии и закрепите иглу в стереотаксической раме. После этого поместите мышь в стереотаксическую раму.

Совместите иглу с центральной точкой появившегося окна, затем опустите иглу до касания поверхности коры. После этого сбросьте цифровые координаты. Теперь введите иглу в ткани коры на 3.2 millimeters.

Затем отведите иглу на 0.2 millimeters и выполните инъекцию на глубине three millimeters. Инъекцию следует проводить со скоростью 10 microliters в минуту. По завершении инъекции оставьте иглу на месте на одну минуту, после чего медленно извлеките ее.

Затем извлеките мышь из зажима. После этого поддерживайте поверхность мозга увлажненной, используя капли стерильного PBS.

Поместите покровное стекло толщиной 3 мм на поверхность мозга, чтобы закрыть окно диаметром 2,7 мм. Затем просушите окружающую кость черепа. После этого нанесите ветеринарный клей (vet bond), чтобы приклеить ткани скальпа к кости черепа и зафиксировать покровное стекло на месте.

Не наносите слишком много состава, так как он может затечь под стекло и ухудшить качество визуализации. Затем в вытяжном шкафу смешайте свежий стоматологический акриловый порошок с раствором и нанесите смесь поверх vet bond с помощью иглы 22G. Чтобы обеспечить герметичность, наносите акрил так, чтобы он слегка заходил на край покровного стекла, но не перекрывал само стекло.

На данном этапе поместите анестезированную мышь в специальный фиксатор головы внутри стереотаксического иррадиатора XAD 2 25 собственной разработки. Выполните конусно-лучевую КТ-сканирование на 360 градусов при пиковом напряжении на рентгеновской трубке 40 kV и силе тока 0,05 mA с использованием алюминиевого фильтра толщиной 2 mm. Используйте полученное изображение для позиционирования предметного столика таким образом, чтобы изоцентр облучения был направлен на правое полушарие и находился по центру в дорсо-вентральном направлении.

Для направления излучения доступно большое разнообразие коллиматоров, что демонстрирует адаптивность данной модели. В данном случае для полусферического облучения мы используем коллиматор размером 8 мм на 11 мм. Вставьте полусферический коллиматор в стереотаксический иррадиатор X RAD 2 25.

Получите одиночные ортогональные КТ-изображения сверху и снизу через коллиматор, чтобы обеспечить правильное позиционирование головы, определив положение анатомических костных структур и вручную точно настроив положение предметного столика по монитору. Замените алюминиевый фильтр облучателя XAD 2 25 IRRADIATOR на медный лечебный фильтр толщиной 0,93 мм. Затем запустите программу рентгеновской трубки при пиковом напряжении 225 кВ и силе тока 13 мА и введите половину дозы облучения сверху в передне-заднем (AP) направлении.

Верните гентри в нижнее положение и введите вторую половину дозы облучения снизу в направлении PA. В ходе данной процедуры проведите анестезию мыши с ранее созданным интракраниальным окном и очистите окно с помощью спиртового спрея. Настройте каналы конфокального микроскопа в соответствии с флуорохромами, интегрированными в созданную химерную мышь.

В качестве альтернативы можно использовать предыдущие настройки, чтобы снизить вариабельность между сеансами визуализации. В этом случае введите любые теги, необходимые для визуализации, в латеральную хвостовую вену (например, декстран для визуализации сосудов). Поместите мышь на специально изготовленный фиксатор головы, используя пластилин для поддержки, при этом убедитесь, что голова расположена перпендикулярно лазеру, и установите фиксатор на подвижный предметный столик микроскопа.

Включите лазер первого канала и направьте его в центр интракраниального окна, глядя непосредственно на точку пересечения лазерного луча на окне камеры. Сделайте снимок каждого канала всего окна с помощью объектива 5x и используйте его в качестве карты для получения других изображений с более высоким разрешением с помощью длиннофокусных объективов 10x и 20x. На данной схеме выделены технические ошибки, связанные с процессом хирургического вмешательства, и продемонстрировано влияние каждой из них на получаемые изображения.

Воздух, скопившийся под окном, будет виден на изображениях в виде пузырьков. Наслоения акрила на стекле проявляют автофлуоресценцию в дальнем красном канале и будут перекрывать часть поля зрения. Аналогично, загрязнения на окне во время получения изображений проявляются в виде автофлуоресцентных вспышек на снимках.

Даже при создании идеального внутричерепного окна могут возникнуть проблемы после размещения препарата под микроскопом. Артефакты дыхания приводят к появлению полос на изображениях, а неправильное позиционирование мыши в зажиме — к сегментации изображения. Поскольку лазер пересекает лишь часть ткани, с помощью последующей обработки изображений можно добавить дополнительный канал для клеток с меткой CFP, что позволит вычесть изображения GFP из изображений CFP для выявления истинного сигнала CFP.

Кроме того, используя характеристику автофлуоресценции при генерации второй гармоники волокнами коллагена IV типа, мы можем визуализировать базальную мембрану сосудов. Наличие пяти флуоресцентных каналов обеспечивает пользователю значительную гибкость и адаптивность новой зеркальной модели, описанной в данной работе. При выполнении этой процедуры важно помнить об опасных веществах, используемых в ходе хирургических манипуляций.

Также крайне важно быть тщательным и уделять особое внимание деталям, чтобы гарантировать отсутствие повреждений тканей мозга на протяжении всей длительной визуализации. После просмотра данного видео вы должны получить четкое представление о том, как создать химерную мышь с флуоресцентными клетками-предшественниками, и, соответственно, сможете получать изображения внутричерепных сосудов в режиме реального времени с высоким разрешением после имплантации опухолевых клеток с терапевтическим вмешательством или без него.