Coculture Анализ внеклеточных белковых взаимодействий влияющие секрецию инсулина клетками поджелудочной железы бета
15 июня 2013 г.
Трансцеллюлярному взаимодействий белка являются важными факторами, определяющими панкреатических бета-клеток. Общий Вот метод, адаптированный из сокультивирования модель синаптогенезе-исследования, как конкретные трансмембранных белков влияют секрецию инсулина. Трансфицированных клеток НЕК293 выразить интерес белков, бета-клетки не нужны для трансфекции или иным образом непосредственно возмущенных.
Общая цель этой процедуры заключается в изучении того, как трансцеллюлярные взаимодействия с участием внеклеточных доменов конкретных трансмембранных белков влияют на функцию бета-клеток и, в частности, на секрецию инсулина. Это достигается путем первого пересечения клеточной линии млекопитающих плазмидой, содержащей интересующий белок на втором этапе. Бета-клеточная линия подвергается совместному культивированию с клетками млекопитающих.
На заключительном этапе ко-культуру инкубируют в средах с различными концентрациями глюкозы, чтобы можно было оценить стимулированную глюкозой секрецию инсулина. В конечном счете, радиоиммунные анализы на инсулин или Элиза используются для оценки уровней инсулина, секретируемого в среду культивируемыми бета-клетками. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как сверхэкспрессия и нокдаун генов, заключается в том, что он позволяет избежать нарушения экспрессии мРНК и белка, потенциально влияющих на здоровье и/или функцию бета-клеток таким образом, что это может затруднить анализ специфического взаимодействия белка.
Начните с переноса ячеек HEC 2 93 в 24-луночный планшет в 0,5 мл среды HEC 2 93 на лунку, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек по дну планшета. Встряхивайте пластину по одной оси со скоростью, синхронной волне, образующейся в скважине. Когда HEC 2 93 клетки достигают 100% бегучести co, трансфектируют культуры 0,8 мкг плазмиды, кодирующей представляющий интерес белок, в двух микролитрах липо 2000.
В соответствии с липопротоколом, общая схема кокультуры, которая будет продемонстрирована, изображена здесь с использованием неферментативного средства для удаления клеток. Начните этот шаг с забора INS 1 клеток с точностью примерно от 70 до 80% со дна колбы с культурой T 75. После раскручивания клеток в течение трех минут при давлении 150 G при комнатной температуре используйте пипетку P 1000 для ресуспендирования гранулы в одном миллилитре половины INS и половины.
Затем с помощью 10-миллилитровой пипетки добавьте еще 24 миллилитра смешанной среды и ресуспендируйте клетки, отсасывайте среду из лунок 24-луночного планшета, содержащего клетки HEC 2 9 3. Затем с помощью пипетки P 1000 аккуратно добавьте 500 микролитров одноклеточной суспензии INS на слой шестигранных клеток вдоль стенок лунки. После каждых шести лунок используйте пипетку объемом 10 миллилитров для повторного суспендирования клеток INS one.
Опять же, чтобы обеспечить однородную клеточную суспензию. Теперь инкубируйте клетки от 24 до 48 часов, в зависимости от протокола эксперимента. После того, как клетки инкубируются в течение желаемого экспериментального периода, по одной лунке за раз, отсасывайте среду для совместного культивирования одной рукой и немедленно заменяйте среду 250 микролитрами 2,5 миллимолярной глюкозы в буфере из бикарбоната Кребса Рингера другой.
После предварительной инкубации сокультур в течение одного часа замените буфер KRB с низким содержанием глюкозы на 250 микролитров глюкозы 2,5 или 20 миллимоляров. После еще одного часа инкубации перенесите буфер KRB в микропробирки и уменьшите буфер в течение пяти минут при температуре 1500 G и четырех градусах Цельсия, пока пробирки находятся в центрифуге. Немедленно добавьте в тарелку 100 микролитров буфера для лизиса риппа с ингибиторами протеазы и инкубируйте пластину в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.
Когда трубки закончат вращаться, удалите 200 микролитров надосадочной жидкости для последующего анализа методом радиоиммуноферментного анализа инсулина или Элизы. Наконец, уменьшите то, что сейчас является клеточным лизатом, в течение 15 минут при 10 000 g, а затем удалите 50 микролитров SNAT для анализа с помощью радиоиммуноферментного анализа инсулина или Элизы. Здесь представлены результаты, полученные при совместном культивировании бета-клеток INS one с клетками HC 2 93, трансфицированных для экспрессии изоформы нейролиггена, называемой здесь NLX.
Экспрессия NLX увеличивала базальную и стимулированную секрецию инсулина ко-культивируемыми клетками I NS one. Внеклеточный домен NX должен взаимодействовать с другим белком или молекулой на поверхности I NS one, чтобы заставить клетки INS one секретировать больше инсулина. Результаты других типов анализов с использованием системы сокультуры представлены на следующих двух графиках.
На этом первом графике показано увеличение содержания инсулина в ко-культивируемых клетках INS One с помощью NLY. В то время как в этом эксперименте РНК была собрана из клеточного слоя и проанализирована с помощью R-T-Q-P-C-R. Совместное культивирование с NLY повышало уровни мРНК инсулина и PDX one.
После этой процедуры могут быть применены дополнительные методы, такие как QPCR или количественная иммуногистохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, могут ли внеклеточные взаимодействия трансфицированного белка вызывать изменения в клеточной структуре или экспрессии генов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании изучается роль трансклеточных белковых взаимодействий в функционировании бета-клеток поджелудочной железы, с особым вниманием к секреции инсулина. Метод заключается в совместном культивировании трансфицированных клеток HEK293 с бета-клетками для оценки влияния специфических трансмембранных белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Эндокринология
Теоретические основы
- Трансцеллюлярные взаимодействия имеют решающее значение для функционирования бета-клеток.
- Секреция инсулина является ключевым процессом, на который влияют эти взаимодействия.
- Существующие методы могут нарушать жизнеспособность бета-клеток, что затрудняет проведение анализа.
- Данное исследование направлено на разработку более совершенного подхода.
Цель исследования
- Исследовать, как специфические трансмембранные белки влияют на секрецию инсулина.
- Использовать модель совместного культивирования для минимизации прямого воздействия на бета-клетки.
- Оценить влияние концентрации глюкозы на высвобождение инсулина.
Используемые методы
- Трансфекция клеток HEK293 плазмидами, содержащими интересующие белки.
- Сокультивирование трансфицированных клеток HEK293 с бета-клетками.
- Инкубация сокультур в средах с различными концентрациями глюкозы.
- Использование радиоиммуноанализа или ИФА (ELISA) для измерения секреции инсулина.
Основные результаты
- Продемонстрировано влияние специфических трансмембранных белков на секрецию инсулина.
- Показано, что концентрация глюкозы влияет на высвобождение инсулина в кокультуре клеток.
- Подтверждена эффективность метода по сравнению с традиционными методами пертурбации.
- Получены новые данные о механизмах функционирования бета-клеток.
Выводы
- Метод совместного культивирования позволяет изучать взаимодействия белков, не нарушая жизнеспособность бета-клеток.
- Полученные данные могут быть использованы в дальнейших исследованиях диабета и функции бета-клеток.
- Данный подход может привести к лучшему пониманию механизмов секреции инсулина.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Понимание трансклеточных белковых взаимодействий имеет решающее значение для снижения рисков при валидации мишеней в бета-клетках в процессе разработки препаратов для лечения диабета. Данный метод совместного культивирования позволяет исследовать механизмы влияния внеклеточных белков на секрецию инсулина, не нарушая жизнеспособность бета-клеток, что повышает прогностическую достоверность при выборе мишени. Это позволяет решить ключевую проблему этапа поиска новых лекарств: дифференцировать истинную трансклеточную сигнализацию от внутриклеточных вмешивающихся факторов при анализе сигнальных путей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проводить функциональную оценку взаимодействия трансмембранных белков при секреции инсулина, сохраняя целостность бета-клеток.
- Операционная ценность: позволяет избежать артефактов, связанных с нокдауном или гиперэкспрессией мРНК/белков, которые могут исказить результаты исследований по валидации мишеней.
- Стратегическая ценность: обеспечивает возможность проведения скрининга внеклеточных интеракторов на основе выдвинутых гипотез для снижения рисков при изучении сигнальных путей бета-клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные показатели секреции инсулина при контролируемой стимуляции глюкозой для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: Использование клеток HEK293 в качестве настраиваемой платформы для презентации внеклеточных белков для проведения воспроизводимых анализов в кокультуре.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает возможность масштабируемой оценки белков-кандидатов, влияющих на функцию бета-клеток, в физиологически релевантном формате.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Связывает внеклеточные белковые взаимодействия с функциональным созреванием бета-клеток и инсулиновым ответом на глюкозу.
- Практическая ценность: Совместим с первичными диссоциированными бета-клетками и линиями бета-клеток для кросс-модельной валидации.
- Стратегическая ценность: Предоставляет релевантную для заболевания систему для приоритизации мишеней с потенциалом согласования с трансляционными биомаркерами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от взаимодействия с мишенью до функциональной валидации, в частности, поддерживая поиск ведущих соединений путем механистического снижения рисков в отношении путей бета-клеток.
- Открывательная биология: Изучение того, как внеклеточные домены специфических трансмембранных белков модулируют секрецию инсулина бета-клетками в контролируемой системе совместного культивирования.
- Скрининг: Обеспечение стандартизированной и воспроизводимой оценки секреции инсулина при различных концентрациях глюкозы с помощью радиоиммуноанализа или ELISA.
- Аналитика: Получение количественных измерений зависимой переменной (уровней инсулина), что позволяет сравнивать эффекты белковых взаимодействий при заданных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Связь фенотипов внеклеточного взаимодействия с изменениями содержания инсулина и экспрессии генов (например, мРНК инсулина, PDX1) для обеспечения преклинической преемственности.
- Корпоративное повторное использование: Создание применимой повторно платформы совместного культивирования для исследования множества трансмембранных белков без необходимости пересмотра основных процедур работы с бета-клетками.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в передаче сигналов бета-клеток путем отделения трансцеллюлярных эффектов от внутриклеточных пертурбаций.
- Практическая ценность: Стандартизирует рабочий процесс совместного культивирования с определенными этапами трансфекции, инкубации и анализа секреции для обеспечения согласованности между исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений «go/no-go» при валидации мишеней, предоставляя функциональные данные о секреции инсулина, не искаженные артефактами состояния здоровья бета-клеток.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе подтвержденного влияния на глюкозозависимую секрецию инсулина.
Особенности реализации
- Требуется опыт в трансфекции клеток млекопитающих, методах совместного культивирования и анализах глюкозозависимой секреции инсулина.
- Результат зависит от контроля эффективности трансфекции и правильного формирования слоя клеток HEK293 для обеспечения стабильной презентации белка.
- Необходима стандартизация протоколов глюкозной нагрузки и методов количественного определения инсулина (радиоиммуноанализа или ELISA) во всех экспериментах.
- При переходе к первичным бета-клеткам или альтернативным линиям бета-клеток, помимо INS-1, следует учитывать особенности адаптации.
- Метод ограничен анализом внеклеточного взаимодействия белков; прямое исследование внутриклеточных сигнальных доменов невозможно без использования дополнительных методов.
