Мультиплексированную Люциферазы скрининга на основе Платформы Допрос связанных с раком передачи сигнала в культуре клеток

Общая цель данного протокола заключается в том, чтобы обеспечить возможность исследования функции генов в масштабе генома путем одновременного мониторинга нескольких клеточных показаний. В этой демонстрации репортеры на базе Firefly RAN и Cipro Dina Luciferase используются для мониторинга активности пути P 53 WINT и KRAS соответственно. Эти три репортера были пересечены с помощью ирнк, нацеленной на интересующий ген в клетки HCT one 16, клеточную линию колоректального рака.

В дальнейшем в клеточных лизатах измеряют активность светлячка и ванильлюциферазы, а также активность ципро ДЭА люциферазы. В культуре измеряется секретируемый фермент. Получены средние результаты, которые демонстрируют воспроизводимость системы анализа, а также способность выявлять общие и уникальные действия генов в рамках этих трех путей, имеющих отношение к раку.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как микролучевая или многоцветная методика, заключается в том, что это доступный, универсальный и экономически эффективный способ посмотреть на транскрипцию клеточных выходов. Этот метод может помочь ответить на такие вопросы в исследованиях рака, как разработка молекулярно-таргетных терапевтических стратегий. Несмотря на то, что наши усилия по протоколу transient transfect IL и минимальные предварительные затраты времени на настройку экрана, они, вероятно, увеличат вариабельность сигнала от скважины к скважине, чему можно противостоять, глядя на соотношения отчетов, а не на абсолютные отказы из лунок.

Используйте один миллилитр раствора трипсина с последующей нейтрализацией 10 миллилитрами DMEM, содержащим 2% FBS и 1% пенициллин. Стрептомицин переносит взвешенные клетки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугирует при температуре около 130 G в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 миллилитрах среды.

Подсчитайте количество клеток с помощью счетчика клеток, а затем сделайте клеточный раствор с 10 до пятой клетки на миллилитр. Сохраните 150 миллилитров клеточной суспензии для следующего шага с помощью автоматической пластины-дозатора жидкости Multi Drop. По 100 микролитров или от 10 до четвертой клетки в каждую лунку 96-луночного культурального планшета.

Суспензия ячеек в этом случае должна быть достаточной для покрытия 1296. Хорошо планшеты инкубируют планшеты с клетками при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с 5% углекислым газом во время приготовления трансфекционной смеси. Использованная здесь высококачественная репортерная ДНК была выделена с помощью стандартных наборов для подготовки MIDI и разбавлена до конечной концентрации один миллиграмм на миллилитр.

Для каждого репортера приготовьте 100 микролитров исходного раствора репортера, соединив следующие 30 микролитров P 53, FL 30 микролитров восьми X-T-C-F-R-L 30 микролитров лося, один G четыре шесть микролитров U-A-S-C-L и четыре микролитра H два oh. В результате получится смесь ДНК с конечным соотношением один к одному к 0,2 репортерам и конечной концентрацией ДНК 0,3 миллиграмма на миллилитр. Далее готовят смеси для трансфекции I-R-N-A-D-N-A, достаточные для трансекции 1296.

Луночные планшеты разводят 80 микролитров репортерного конструктивного стокового раствора в восьми миллилитрах EC-буфера из набора для воздействия QIAGEN для получения раствора ДНК с конечной концентрацией три микрограмма на миллилилитровую пластину. По 20 микролитров раствора ДНК в каждую лунку 96-луночного ПЦР-планшета. Количество 96 скважинных планшетов будет зависеть от того, сколько бассейнов IRNA будет протестировано.

Например, в этом случае нам потребуется 4 96 луночных планшетов для оценки. 384 различных пула с помощью автоматизированного обработчика жидкостей биома переносят два микролитра из каждых пяти микромолярных миРНК в соответствующую лунку ПЦР-планшета, содержащую разбавленный запас ДНК. Затем добавьте по одному микролитру раствора энхансера в каждую лунку пластины ДНК миРНК.

Дайте усилителю реакции протекать при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем добавьте в каждую лунку по три микролитра эффективного реагента для трансфекции и выдерживайте при комнатной температуре еще 10 минут. Чтобы остановить образование трансфекционного комплекса, добавьте в каждую лунку ПЦР-планшета по 10 микролитров DMEM, содержащего 2% FBS и 1% пенициллина стрептомицина.

Достаньте из инкубатора планшеты на 1296 лунок, содержащие HCT 1 16 клеток. Перенесите 10 микролитров смеси для трансфекции в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего клетки, так как каждая трансфекция будет выполняться в трех экземплярах. Та же смесь будет нанесена на два дополнительных 96-луночных планшета, содержащих клетки.

Инкубируйте клетки с помощью трансфекционных смесей при температуре 37 градусов Цельсия во влажной среде с 5% углекислым газом в течение 36 часов. Через 36 часов после трансфекции клеток. Действия люциферазы готовы к измерению.

Поскольку в этом исследовании задействовано несколько репортеров, один из которых секретируется в культуральной среде, а два других экспрессируются в цитоплазме клетки. Измерения будут получены как из культуральной среды, так и из клеточного лизата для обнаружения активности ципродина люциферазы или CL в культуре. Средняя реплика пластины.

20 микролитров питательной среды на белую непрозрачную 96-луночную пластину. С помощью мультикапли добавьте в каждую лунку по 20 микролитров буфера для анализа CL. Затем добавьте по 10 микролитров Ципро Дина Люцифера и субстрата в каждую лунку и определите активность CL с помощью люминометра для обнаружения активности люциферазы светлячков и ванильной люциферазы, предварительно необходимо сделать клеточные лизаты.

Удалите питательную среду из клеток, перевернув каждую пластину вверх дном и бросив среду в раковину. Удалите остатки среды, аккуратно постукивая по перевернутой тарелке по бумажным полотенцам. Добавьте 30 микролитров одного буфера пассивного лизиса в каждую лунку клеток.

Поместите пластины на платформу, установленную на средних оборотах, на пять минут при комнатной температуре. Через пять минут добавьте по 20 микролитров реактива для анализа люциферазы в каждую лунку клеток и немедленно измерьте активность люциферазы светлячков с помощью люминометра. Затем добавьте реагент для остановки и свечения, чтобы погасить активность люциферазы светлячков, а затем измерьте активность люциферазы.

Перед мультиплексированием была проведена индивидуальная оценка надежности трех различных платформ досмотра. Указанные клеточные линии колоректального рака трансфицировали восемью репортерными конструкциями XTCF, PP, 53 ta Luke или ALK, кодирующими люциферазу, вместе с пулами миРНК, нацеленных на WINT, бета-катенин P 53 или KAS соответственно. Указаны соответствующие пути генотипы для каждой клеточной линии.

Эффективность каждой скрининговой платформы оценивалась по воспроизводимости этих индуцированных эффектов на соответствующем пути передачи сигнала. Как показано в этих репрезентативных результатах, бетаин и миРНК не оказывают влияния на активность восьми репортеров XTCF в клетках RKO. В отличие от DLD one и HCT one 16 клеток, которые соответственно испытывают дефицит пути A PC, белка-супрессора и экспрессируют активированную форму бека тенина.

Впоследствии было показано, что эти репортеры могут быть использованы вместе для одновременного измерения активности генов ветряного бета-катенина P 53 и путей передачи сигнала KRAS с использованием указанных пулов IRNA на этих графиках. Относительная активность люциферазы показана по оси Y, а миРНК, нацеленные на указанный ген, представляющий интерес, показаны по оси X. Например, пул миРНК, нацеленный на бета-катенин, снижает активность пути бета-катенина ветра, не оказывая при этом существенного влияния на пути P 53 и KRA S.

При попытке разработки мультиплексной репортерной системы важно оптимизировать интересующую клеточную линию для области трансфекции и намерения сигнала репортера.