1.10: Знакомство со спектрофотометром

Спектрофотометр широко используется в биологических, химических, клинических и экологических исследованиях.

Спектрофотометрия — это количественное измерение того, насколько химическое вещество поглощает свет путем пропускания луча света через образец с помощью спектрофотометра.

Измеряя интенсивность обнаруженного света, этот метод может быть использован для определения концентрации растворенного вещества в образце.

Луч света, который излучается в сторону образца, состоит из потока фотонов.

Когда фотоны сталкиваются с молекулами в образце, молекулы могут поглощать некоторые из них, уменьшая количество фотонов в луче света и уменьшая интенсивность регистрируемого сигнала.

Коэффициент пропускания — это доля света, проходящего через образец, которая определяется как интенсивность света, проходящего через образец, по отношению к интенсивности падающего света. Поглощение — это обратный логарифм коэффициента пропускания и это величина, которую будет измерять спектрофотометр.

По абсорбции концентрацию раствора образца можно определить из закона Бера-Ламберта, который гласит, что существует линейная зависимость между поглощением и концентрацией образца. Согласно закону Бера-Ламберта, поглощение является произведением коэффициента затухания, меры того, насколько сильно растворенное вещество поглощает свет на данной длине волны, длины, на которую свет проходит через образец, или длины пути, и концентрации растворенного вещества. Часто целью измерения абсорбционной способности является измерение концентрации образца.

Каждый спектрофотометр включает в себя источник света, коллиматор, представляющий собой линзу или фокусирующее устройство, пропускающее интенсивный прямой пучок света, монохроматор для разделения луча света на составляющие его длины волн и селектор длины волны, или щель, для выбора нужной длины волны. Длины волн света, используемые в спектрофотометрах, обсуждаемых в этом видео, находятся в ультрафиолетовом и видимом диапазонах. Спектрофотометр также включает в себя своего рода держатель образца, фотоэлектрический детектор, который обнаруживает количество поглощенных фотонов, и экран для отображения выходных данных детектора.

Новые спектрофотометры напрямую связаны с компьютером, где можно контролировать параметры эксперимента и отображать результаты.

При выполнении спектрофотометрии обязательно принимайте соответствующие меры предосторожности, такие как ношение перчаток, в зависимости от типа биологических или химических растворов, с которыми вы работаете.

Перед измерением УФ-видимого спектра образца включите машину и дайте лампам и электронике нагреться.

Приготовьте заготовку из того же раствора, но без аналита, имеющую тот же pH и аналогичную ионную силу; Это необходимый шаг, так как элемент и растворитель могут рассеивать некоторое количество света.

Традиционные держатели образцов спектрофотометра предназначены для хранения пластиковых и кварцевых кювет. Приступайте к пипетке пустого раствора в кювету.

После удаления отпечатков пальцев и разливов с внешней стороны кюветы правильно вставьте кювету в держатель для образцов и закройте дверцу отсека для кювет.

Никогда не забывайте закрывать дверцу, так как ультрафиолетовое излучение, излучаемое открытым спектрофотометром, может повредить глаза и кожу.

Установите желаемую длину волны или диапазон длин волн, которые будут передаваться на образце, который зависит от оптимальной длины волны света, поглощаемого анализируемым веществом. Затем обнулите прибор, сняв показания с заготовки, что вычтет фон из буфера выборки.

В зависимости от типа спектрофотометрического эксперимента, который вы проводите, может потребоваться построить стандартную кривую перед измерением образца, по которой в конечном итоге можно определить концентрацию анализируемого вещества образца.

Дайте образцу нагреться до нужной температуры и аккуратно перемешайте, чтобы не появились пузырьки. Образец может быть добавлен непосредственно в кювету, внутри инструмента, и сняты показания.

После выполнения измерения поглощения на вашем образце приступайте к соответствующему расчету для вашего эксперимента; Например, определение концентрации или скорости активности фермента.

Спектрофотометр ежедневно используется во многих биологических исследовательских лабораториях.

Одним из распространенных применений спектрофотометра является измерение плотности клеток. Измерение плотности клеток полезно для построения логарифмических кривых роста бактерий, по которым можно определить оптимальное время для индукции рекомбинантного белка.

Спектрофотометр также может использоваться для измерения скорости химических реакций. В этом примере абсорбция используется для мониторинга ферментативной реакции путем исчезновения промежуточного продукта реакции при длине волны 452 нм с течением времени. Скорость этого ферментативного шага может быть рассчитана путем подгонки данных к соответствующему уравнению.

В последнее время с внедрением микрообъемных спектрофотометров отпала необходимость в держателях образцов. Такие спектрофотометры используют поверхностное натяжение для удержания образца.

Микрообъемные спектрофометры оптимальны для измерения качества и концентрации дорогостоящих образцов ограниченного объема, таких как биомолекулы, в том числе белки и нуклеиновые кислоты.

Абсорбция белка при длине волны 280 нм зависит от содержания ароматических боковых цепей, обнаруженных в триптофане, тирозине и фенилаланине, а также от наличия цистеин-цистеиновых дисульфидных связей.

Концентрацию белка можно определить по его абсорбции при 280 нм и коэффициенту экстинкции, который основан на аминокислотном составе.

Как ДНК, так и РНК имеют максимум поглощения на длине волны 260 нм, по которому можно определить их концентрацию. Чистоту нуклеиновой кислоты также можно оценить по соотношению показаний поглощения на определенных длинах волн.

Вы только что посмотрели представление JoVE о спектрофотометре.

В этом видео мы рассмотрели некоторые основные принципы, включая концепции спектрофотометрии и компоненты спектрофотометра. Мы также пошагово продемонстрировали работу спектрофотометра и обсудили его использование в биологических исследованиях. Спасибо за просмотр.