Введение в работу со спектрофотометром

Спектрофотометр является повсеместно используемым прибором в биологических, химических, клинических и экологических исследованиях.

Спектрофотометрия — это количественное измерение того, сколько света поглощает химическое вещество, при пропускании луча света через образец с помощью спектрофотометра.

Путем измерения интенсивности детектируемого света данный метод может быть использован для определения концентрации растворенного вещества в образце.

Световой луч, направленный на образец, представляет собой поток фотонов.

Когда фотоны взаимодействуют с молекулами в образце, молекулы могут поглощать часть из них, что снижает количество фотонов в световом луче и уменьшает интенсивность регистрируемого сигнала.

Светопропускание — это доля света, проходящая через образец; оно определяется как отношение интенсивности света, прошедшего через образец, к интенсивности падающего света. Оптическая плотность (абсорбция) представляет собой обратный логарифм светопропускания и является величиной, которую измеряет спектрофотометр.

На основании значения оптической плотности можно определить концентрацию раствора образца по закону Бугера — Ламберта — Бера, согласно которому между оптической плотностью и концентрацией образца существует линейная зависимость. Согласно этому закону, оптическая плотность равна произведению коэффициента экстинкции (показателя того, насколько сильно растворенное вещество поглощает свет на данной длине волны), длины пути света через образец (длины кюветы) и концентрации растворенного вещества. Зачастую целью измерения оптической плотности является определение концентрации образца.

Каждый спектрофотометр состоит из источника света, коллиматора, который представляет собой линзу или фокусирующее устройство, передающее интенсивный параллельный пучок света, монохроматора для разделения пучка света на составляющие его длины волн, и селектора длин волн (щели) для выбора нужной длины волны. Длины волн света, используемые в спектрофотометрах, рассматриваемых в данном видео, относятся к ультрафиолетовой и видимой областям спектра. Спектрофотометр также включает в себя держатель для образцов, фотоэлектрический детектор, который регистрирует количество поглощенных фотонов, и экран для отображения выходных данных детектора.

Современные спектрофотометры подключаются напрямую к компьютеру, с помощью которого можно управлять параметрами эксперимента и отображать полученные результаты.

При проведении спектрофотометрии обязательно соблюдайте необходимые меры предосторожности, такие как использование перчаток, в зависимости от типа используемых биологических или химических растворов.

Перед измерением УФ-видимого спектра образца включите прибор и дайте лампам и электронике прогреться.

Подготовьте холостой образец (blank) того же раствора, но без аналита, имеющий такой же pH и аналогичную ионную силу; это необходимый этап, так как кювета и растворитель могут рассеивать часть света.

Традиционные держатели образцов спектрофотометра предназначены для пластиковых и кварцевых кювет. Перенесите с помощью пипетки холостой раствор в кювету.

Протерев внешнюю поверхность кюветы от отпечатков пальцев и капель жидкости, правильно установите кювету в держатель и закройте дверцу отделения для кювет.

Никогда не забывайте закрывать дверцу, так как УФ-излучение, исходящее из открытого спектрофотометра, может повредить глаза и кожу.

Установите желаемую длину волны или диапазон длин волн для облучения образца, исходя из оптимальной длины волны поглощения аналита. Затем обнулите прибор, измерив поглощение холостого образца, чтобы вычесть фоновое поглощение буфера из показаний вашего образца.

В зависимости от типа проводимого спектрофотометрического эксперимента перед измерением образца может потребоваться построение градуировочного графика, по которому в дальнейшем можно будет определить концентрацию аналита в вашем образце.

Доведите образец до подходящей температуры и аккуратно перемешайте его, чтобы не допустить образования пузырьков. Затем образец можно добавить непосредственно в кювету, находящуюся в приборе, и произвести измерение.

После измерения абсорбции вашего образца перейдите к соответствующим расчетам для вашего эксперимента; например, к определению концентрации или скорости ферментативной активности.

Спектрофотометр ежедневно используется во многих биологических исследовательских лабораториях.

Одним из распространенных применений спектрофотометра является измерение плотности клеток. Измерение плотности клеток полезно при построении логарифмических кривых роста бактерий, на основании которых можно определить оптимальное время для индукции рекомбинантного белка.

Спектрофотометр также может быть использован для измерения скоростей химических реакций. В данном примере абсорбция используется для мониторинга ферментативной реакции по исчезновению промежуточного продукта реакции при 452 nm с течением времени. Скорость этого ферментативного этапа может быть рассчитана путем аппроксимации данных соответствующим уравнением.

Недавнее появление микрообъемных спектрофотометров устранило необходимость в кюветах. Такие спектрофотометры используют поверхностное натяжение для удержания образца.

Микрообъемные спектрофотометры оптимальны для измерения качества и концентрации дорогостоящих образцов ограниченного объема, таких как биомолекулы, включая белки и нуклеиновые кислоты.

Абсорбция белка при 280 nm зависит от содержания ароматических боковых цепей триптофана, тирозина и фенилаланина, а также от наличия дисульфидных связей между остатками цистеина.

Концентрация белка может быть определена по его абсорбции при 280 nm и коэффициенту экстинкции, который зависит от аминокислотного состава.

Как ДНК, так и РНК имеют максимум абсорбции при 260 nm, по которому можно определить их концентрацию. Чистота нуклеиновой кислоты также может быть оценена по соотношению показателей абсорбции на определенных длинах волн.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по работе со спектрофотометром.

В этом видео мы рассмотрели некоторые базовые принципы, включая концепции спектрофотометрии и компоненты спектрофотометра. Мы также поэтапно продемонстрировали работу с прибором и обсудили его применение в биологических исследованиях. Спасибо за просмотр.