Введение в работу со спектрофотометром
Спектрофотометр является прибором, регулярно используемым в научных исследованиях. Спектрофотометрия представляет собой количественное измерение того,…
Спектрофотометр является повсеместно используемым прибором в биологических, химических, клинических и экологических исследованиях.
Спектрофотометрия — это количественное измерение того, сколько света поглощает химическое вещество, при пропускании луча света через образец с помощью спектрофотометра.
Путем измерения интенсивности детектируемого света данный метод может быть использован для определения концентрации растворенного вещества в образце.
Световой луч, направленный на образец, представляет собой поток фотонов.
Когда фотоны взаимодействуют с молекулами в образце, молекулы могут поглощать часть из них, что снижает количество фотонов в световом луче и уменьшает интенсивность регистрируемого сигнала.
Светопропускание — это доля света, проходящая через образец; оно определяется как отношение интенсивности света, прошедшего через образец, к интенсивности падающего света. Оптическая плотность (абсорбция) представляет собой обратный логарифм светопропускания и является величиной, которую измеряет спектрофотометр.
На основании значения оптической плотности можно определить концентрацию раствора образца по закону Бугера — Ламберта — Бера, согласно которому между оптической плотностью и концентрацией образца существует линейная зависимость. Согласно этому закону, оптическая плотность равна произведению коэффициента экстинкции (показателя того, насколько сильно растворенное вещество поглощает свет на данной длине волны), длины пути света через образец (длины кюветы) и концентрации растворенного вещества. Зачастую целью измерения оптической плотности является определение концентрации образца.
Каждый спектрофотометр состоит из источника света, коллиматора, который представляет собой линзу или фокусирующее устройство, передающее интенсивный параллельный пучок света, монохроматора для разделения пучка света на составляющие его длины волн, и селектора длин волн (щели) для выбора нужной длины волны. Длины волн света, используемые в спектрофотометрах, рассматриваемых в данном видео, относятся к ультрафиолетовой и видимой областям спектра. Спектрофотометр также включает в себя держатель для образцов, фотоэлектрический детектор, который регистрирует количество поглощенных фотонов, и экран для отображения выходных данных детектора.
Современные спектрофотометры подключаются напрямую к компьютеру, с помощью которого можно управлять параметрами эксперимента и отображать полученные результаты.
При проведении спектрофотометрии обязательно соблюдайте необходимые меры предосторожности, такие как использование перчаток, в зависимости от типа используемых биологических или химических растворов.
Перед измерением УФ-видимого спектра образца включите прибор и дайте лампам и электронике прогреться.
Подготовьте холостой образец (blank) того же раствора, но без аналита, имеющий такой же pH и аналогичную ионную силу; это необходимый этап, так как кювета и растворитель могут рассеивать часть света.
Традиционные держатели образцов спектрофотометра предназначены для пластиковых и кварцевых кювет. Перенесите с помощью пипетки холостой раствор в кювету.
Протерев внешнюю поверхность кюветы от отпечатков пальцев и капель жидкости, правильно установите кювету в держатель и закройте дверцу отделения для кювет.
Никогда не забывайте закрывать дверцу, так как УФ-излучение, исходящее из открытого спектрофотометра, может повредить глаза и кожу.
Установите желаемую длину волны или диапазон длин волн для облучения образца, исходя из оптимальной длины волны поглощения аналита. Затем обнулите прибор, измерив поглощение холостого образца, чтобы вычесть фоновое поглощение буфера из показаний вашего образца.
В зависимости от типа проводимого спектрофотометрического эксперимента перед измерением образца может потребоваться построение градуировочного графика, по которому в дальнейшем можно будет определить концентрацию аналита в вашем образце.
Доведите образец до подходящей температуры и аккуратно перемешайте его, чтобы не допустить образования пузырьков. Затем образец можно добавить непосредственно в кювету, находящуюся в приборе, и произвести измерение.
После измерения абсорбции вашего образца перейдите к соответствующим расчетам для вашего эксперимента; например, к определению концентрации или скорости ферментативной активности.
Спектрофотометр ежедневно используется во многих биологических исследовательских лабораториях.
Одним из распространенных применений спектрофотометра является измерение плотности клеток. Измерение плотности клеток полезно при построении логарифмических кривых роста бактерий, на основании которых можно определить оптимальное время для индукции рекомбинантного белка.
Спектрофотометр также может быть использован для измерения скоростей химических реакций. В данном примере абсорбция используется для мониторинга ферментативной реакции по исчезновению промежуточного продукта реакции при 452 nm с течением времени. Скорость этого ферментативного этапа может быть рассчитана путем аппроксимации данных соответствующим уравнением.
Недавнее появление микрообъемных спектрофотометров устранило необходимость в кюветах. Такие спектрофотометры используют поверхностное натяжение для удержания образца.
Микрообъемные спектрофотометры оптимальны для измерения качества и концентрации дорогостоящих образцов ограниченного объема, таких как биомолекулы, включая белки и нуклеиновые кислоты.
Абсорбция белка при 280 nm зависит от содержания ароматических боковых цепей триптофана, тирозина и фенилаланина, а также от наличия дисульфидных связей между остатками цистеина.
Концентрация белка может быть определена по его абсорбции при 280 nm и коэффициенту экстинкции, который зависит от аминокислотного состава.
Как ДНК, так и РНК имеют максимум абсорбции при 260 nm, по которому можно определить их концентрацию. Чистота нуклеиновой кислоты также может быть оценена по соотношению показателей абсорбции на определенных длинах волн.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по работе со спектрофотометром.
В этом видео мы рассмотрели некоторые базовые принципы, включая концепции спектрофотометрии и компоненты спектрофотометра. Мы также поэтапно продемонстрировали работу с прибором и обсудили его применение в биологических исследованиях. Спасибо за просмотр.
Спектрофотометр является повсеместно используемым прибором в биологических, химических, клинических и экологических исследованиях.
Спектрофотометрия — это количественное измерение того, сколько света поглощает химическое вещество, при пропускании луча света через образец с помощью спектрофотометра.
Путем измерения интенсивности детектируемого света данный метод может быть использован для определения концентрации растворенного вещества в образце.
Световой луч, направленный на образец, представляет собой поток фотонов.
Когда фотоны взаимодействуют с молекулами в образце, молекулы могут поглощать часть из них, что снижает количество фотонов в световом луче и уменьшает интенсивность регистрируемого сигнала.
Светопропускание — это доля света, проходящая через образец; оно определяется как отношение интенсивности света, прошедшего через образец, к интенсивности падающего света. Оптическая плотность (абсорбция) представляет собой обратный логарифм светопропускания и является величиной, которую измеряет спектрофотометр.
На основании значения оптической плотности можно определить концентрацию раствора образца по закону Бугера — Ламберта — Бера, согласно которому между оптической плотностью и концентрацией образца существует линейная зависимость. Согласно этому закону, оптическая плотность равна произведению коэффициента экстинкции (показателя того, насколько сильно растворенное вещество поглощает свет на данной длине волны), длины пути света через образец (длины кюветы) и концентрации растворенного вещества. Зачастую целью измерения оптической плотности является определение концентрации образца.
Каждый спектрофотометр состоит из источника света, коллиматора, который представляет собой линзу или фокусирующее устройство, передающее интенсивный параллельный пучок света, монохроматора для разделения пучка света на составляющие его длины волн, и селектора длин волн (щели) для выбора нужной длины волны. Длины волн света, используемые в спектрофотометрах, рассматриваемых в данном видео, относятся к ультрафиолетовой и видимой областям спектра. Спектрофотометр также включает в себя держатель для образцов, фотоэлектрический детектор, который регистрирует количество поглощенных фотонов, и экран для отображения выходных данных детектора.
Современные спектрофотометры подключаются напрямую к компьютеру, с помощью которого можно управлять параметрами эксперимента и отображать полученные результаты.
При проведении спектрофотометрии обязательно соблюдайте необходимые меры предосторожности, такие как использование перчаток, в зависимости от типа используемых биологических или химических растворов.
Перед измерением УФ-видимого спектра образца включите прибор и дайте лампам и электронике прогреться.
Подготовьте холостой образец (blank) того же раствора, но без аналита, имеющий такой же pH и аналогичную ионную силу; это необходимый этап, так как кювета и растворитель могут рассеивать часть света.
Традиционные держатели образцов спектрофотометра предназначены для пластиковых и кварцевых кювет. Перенесите с помощью пипетки холостой раствор в кювету.
Протерев внешнюю поверхность кюветы от отпечатков пальцев и капель жидкости, правильно установите кювету в держатель и закройте дверцу отделения для кювет.
Никогда не забывайте закрывать дверцу, так как УФ-излучение, исходящее из открытого спектрофотометра, может повредить глаза и кожу.
Установите желаемую длину волны или диапазон длин волн для облучения образца, исходя из оптимальной длины волны поглощения аналита. Затем обнулите прибор, измерив поглощение холостого образца, чтобы вычесть фоновое поглощение буфера из показаний вашего образца.
В зависимости от типа проводимого спектрофотометрического эксперимента перед измерением образца может потребоваться построение градуировочного графика, по которому в дальнейшем можно будет определить концентрацию аналита в вашем образце.
Доведите образец до подходящей температуры и аккуратно перемешайте его, чтобы не допустить образования пузырьков. Затем образец можно добавить непосредственно в кювету, находящуюся в приборе, и произвести измерение.
После измерения абсорбции вашего образца перейдите к соответствующим расчетам для вашего эксперимента; например, к определению концентрации или скорости ферментативной активности.
Спектрофотометр ежедневно используется во многих биологических исследовательских лабораториях.
Одним из распространенных применений спектрофотометра является измерение плотности клеток. Измерение плотности клеток полезно при построении логарифмических кривых роста бактерий, на основании которых можно определить оптимальное время для индукции рекомбинантного белка.
Спектрофотометр также может быть использован для измерения скоростей химических реакций. В данном примере абсорбция используется для мониторинга ферментативной реакции по исчезновению промежуточного продукта реакции при 452 nm с течением времени. Скорость этого ферментативного этапа может быть рассчитана путем аппроксимации данных соответствующим уравнением.
Недавнее появление микрообъемных спектрофотометров устранило необходимость в кюветах. Такие спектрофотометры используют поверхностное натяжение для удержания образца.
Микрообъемные спектрофотометры оптимальны для измерения качества и концентрации дорогостоящих образцов ограниченного объема, таких как биомолекулы, включая белки и нуклеиновые кислоты.
Абсорбция белка при 280 nm зависит от содержания ароматических боковых цепей триптофана, тирозина и фенилаланина, а также от наличия дисульфидных связей между остатками цистеина.
Концентрация белка может быть определена по его абсорбции при 280 nm и коэффициенту экстинкции, который зависит от аминокислотного состава.
Как ДНК, так и РНК имеют максимум абсорбции при 260 nm, по которому можно определить их концентрацию. Чистота нуклеиновой кислоты также может быть оценена по соотношению показателей абсорбции на определенных длинах волн.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по работе со спектрофотометром.
В этом видео мы рассмотрели некоторые базовые принципы, включая концепции спектрофотометрии и компоненты спектрофотометра. Мы также поэтапно продемонстрировали работу с прибором и обсудили его применение в биологических исследованиях. Спасибо за просмотр.
Q1: How does a spectrophotometer measure the concentration of a solute in a solution?
A spectrophotometer measures concentration by quantifying how much light a sample absorbs. When a beam of light passes through the sample, molecules absorb photons, reducing light intensity. The instrument measures absorbance, which relates directly to solute concentration through the Beer-Lambert Law. This linear relationship between absorbance and concentration allows researchers to determine unknown concentrations from measured absorbance values.
Q2: What is the difference between transmittance and absorbance in spectrophotometry?
Transmittance is the fraction of light that passes through a sample, calculated as the intensity of transmitted light divided by incident light intensity. Absorbance is the inverse logarithm of transmittance and represents how much light the sample absorbs. Spectrophotometers directly measure absorbance, which is the more useful parameter for determining solute concentration using the Beer-Lambert Law.
Q3: What are the main components of a spectrophotometer and what does each do?
A spectrophotometer contains a light source, collimator that focuses light into a straight beam, monochromator that separates light into component wavelengths, and a wavelength selector or slit for choosing the desired wavelength. It also includes a sample holder for cuvettes, a photoelectric detector that measures absorbed photons, and a display screen. Newer models connect directly to computers for experiment control and data display.
Q4: Why is it important to prepare a blank solution before measuring a sample?
A blank solution contains the same solvent and buffer as the sample but without the analyte. The cell and solvent can scatter light, creating background absorbance. By zeroing the instrument with the blank, this background is subtracted from your sample measurement, ensuring accurate absorbance readings. The blank must have the same pH and similar ionic strength as your sample for proper calibration.
Q5: How can spectrophotometry be used to monitor enzyme activity in real time?
Spectrophotometry monitors enzyme activity by tracking changes in absorbance over time. For example, if an enzymatic reaction produces or consumes a compound with a specific absorbance maximum, researchers can measure absorbance at that wavelength repeatedly. The rate of absorbance change reflects the reaction rate, allowing calculation of enzyme kinetics. This method is particularly useful for monitoring disappearance of reaction intermediates at specific wavelengths like 452 nanometers.
Q6: What are the advantages of microvolume spectrophotometers for measuring biomolecules?
Microvolume spectrophotometers use surface tension to hold samples, eliminating the need for traditional cuvette holders. They are optimal for measuring expensive, limited-volume samples such as proteins and nucleic acids. These instruments can determine protein concentration from absorbance at 280 nanometers based on aromatic amino acid content, and assess nucleic acid concentration and purity from absorbance readings at 260 nanometers.
Q7: What precautions should be taken when operating a spectrophotometer?
Always wear appropriate gloves when handling biological or chemical solutions. Allow the instrument to warm up before use. Never leave the cuvette compartment door open, as UV radiation can damage eyes and skin. Before inserting the cuvette, wipe away fingerprints and spills from the outside. Allow samples to reach the appropriate temperature and mix gently to avoid introducing bubbles that could affect measurements.