Визуализации и анализа молекул мРНК с помощью флуоресцентной В Ситу Гибридизация в Saccharomyces CEREVISIAE

Общей целью данного эксперимента является обнаружение присутствия молекул мРНК с одномолекулярной специфичностью в одиночных дрожжевых клетках. Сначала закрепите дрожжевые клетки и формальдегид с помощью буфера, содержащего лиазу. Проницаемы для клеток до тех пор, пока большинство клеток не станут фазированными яркими.

Затем инкубируйте клетки пермы с флуоресцентно помеченными одноцепочечными молекулами ДНК, а затем закрепите клетки на очищенном плазмой покровном листе. В конечном счете, результаты, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, могут детализировать присутствие и локализацию молекул мРНК в отдельных клетках. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как экспрессия генов, микрочипы и нортерн-блоты, заключается в том, что отдельные мРНК могут быть визуализированы в отдельных клетках.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области транскрипции. Это включает в себя количественную оценку количества РНК рук на клетку в популяции, что может служить основой для моделей регуляции на уровне промотора. Он также может быть использован для определения локализации и периода полураспада транскриптов в течение клеточного цикла.

В плазменной предельной вакуумной камере крышка положения скользит по предметным стеклам. Затем поместите вакуумную камеру в микроволновую печь и убедитесь, что она герметична. Включите насос после его запуска.

Включите пылесос, теперь включите микроволновую печь и остановитесь через пять секунд после того, как плазма станет видна. Затем выключите пылесос, а затем и насос. Вытащите вакуумную камеру.

Затем переложите зачищенную сторону крышки вверх на 12. В скважинах дрожжи выращиваются до А 600 примерно от 0,1 до 0,2. В минимальных средах 10 мил клеток дают достаточно для примерно 10 гибридизации.

Добавьте один 10-й объем 37%-ного формальдегида непосредственно в питательную среду и инкубируйте при комнатной температуре в течение 45 минут. Центрифугируйте клетки при давлении 3000 G в течение пяти минут. Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре буфера B и переложите в микроцентрифужную пробирку.

Дважды промыть с одним миллилитром ледяного буфера B в микроцентрифужной пробирке. Центрифугируйте при 13 000 об/мин в течение одной минуты. Далее добавьте один миллилитр сферического покрытия, буферизуйте и выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Контролируйте клетки под микроскопом каждые несколько минут, пока большинство клеток не станут черными. Затем дважды постирайте ледяным буфером. Б. Вращение на низкой скорости 3, 500 об/мин.

Добавьте один миллилитр 70% этанола резус. Аккуратно подвесьте гранулу и поставьте на ночь при температуре четыре градуса Цельсия или храните неопределенно долго при температуре минус 20 градусов Цельсия. Чтобы приготовить гибридизационный раствор, добавьте от одного до трех микролитров зонда на 100 микролитров гибридизационного буфера.

Затем вихревой и центрифуг. Мы визуализировали три разных гена одновременно с помощью трех разных наборов зондов. Теперь центрифугируйте неподвижный образец дрожжей и отсадите его из буфера для промывки.

Добавьте раствор для гибридизации и инкубируйте в темноте с легким встряхиванием в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия на следующий день. Обработайте чистые покровные губы 150 микролитрами 0,01% полилизина в течение пяти минут. Затем аспир и сушка на воздухе.

Предметные стекла трижды промывают дистиллированной водой и сушат на воздухе после одной промывки одним XSSC Resus, суспензируют клетки в 150 микролитриях по 0,1 микрограмма на миллилитр. Свежеприготовленную лепестку окрашиваем аликвотой клеточной суспензии на обработанную полилизином крышку и выдерживаем в течение 30 минут. Далее разморозьте пролонгированную золотую монтажную среду до комнатной температуры.

Налейте три микролитра на предметное стекло. Затем добавьте около 0,5 миллилитров этанола в покровный лист. В 12-луночной пластине снимите крышку, проскользните и высушите на воздухе, держа пинцетом.

Поместите защитную ячейку скользящей стороной вниз на монтажный носитель и дайте ей застыть в течение нескольких часов или на ночь в темноте. Заклейте края лаком для ногтей и приступайте к визуализации. Сделайте несколько снимков вокруг точки отсчета, где общее расстояние составляет пять микрометров с размером 0,2 микрометра.

Повторите визуализацию для каждого канала красителя, соответствующего каждому набору зондов. Затем действуйте, как указано в сопроводительном тексте. Чтобы идентифицировать клетки с помощью сегментации водораздела, определите пятна с помощью радиального градиента и измерьте пятна с помощью гауссова аппроксимации.

Как правило, гистограммы вычисляются на основе изображений рыб и используются для определения количества мРНК, присутствующих в отдельных клетках. Важным преимуществом количественного определения РНК на основе микроскопии является то, что можно получить информацию о локализации транскриптов. Например, эта рыба использует одиночные зонды для идентификации мРНК в одиночных клетках с индуцируемым аллем CCB CBF one.

Поскольку в месте транскрипции присутствует много молекул мРНК, легко определить наличие и расположение сайтов транскрипции в ядре. Использование различных красителей для маркировки мРНК разных генов облегчает количественное определение нескольких видов мРНК в одних и тех же клетках. В этом эксперименте дрожжевые клетки инкубировались в присутствии альфа-фактора и сорбита Данные показывают, что одна клетка реагирует только на феромон, обозначенный красным FUS one start site.

В то же время другая клетка преимущественно реагирует на сорбит, где S TL one start site помечен зеленым цветом. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как маркировать и визуализировать отдельные молекулы мРНК в дрожжах после освоения. Эту методику можно правильно выполнить за два дня.

Помните о достаточно плотной концентрации клеток. Разбавленные образцы требуют большего количества полей для отображения и хранения.