Корреляционно микроскопии для 3D Структурный анализ динамических взаимодействий

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать использование метода корреляционного флуоресцентного света и криоэлектронной микроскопии путем визуализации динамических малых частиц ВИЧ-1, взаимодействующих с хел-клетками хозяина. Это достигается путем предварительного осаждения и выращивания клеток пятки на сетке ЭМ с золотым искателем в чашке для культуры со стеклянным дном и заражения клеток пятки частицами ВИЧ, меченными GFP. Второй шаг заключается в сборе высокоскоростных 3D-изображений живых клеток инфицированных ВИЧ и анализе изображений с помощью автоматизированного 3D-отслеживания частиц для динамики отдельных частиц после витрификации.

Образец, те же вирусные частицы из данных визуализации живой клетки, размещаются на криофлуоресцентных изображениях для дальнейшего анализа с помощью 3D криоэлектронной томографии с высоким разрешением. Заключительным этапом является сбор ряда наклонных криопроекций для всех выявленных положений, содержащих частицы ВИЧ-1, и реконструкция 3D-томов с помощью алгоритма взвешенной обратной проекции с использованием программного обеспечения imad. В конечном счете, передовая 3D-коррелятивная флуоресцентная микроскопия живых клеток и криоэлектронная томография высокого разрешения используются для непосредственной визуализации динамических дифракционных ограниченных вирусных частиц и их взаимодействия с клетками-хозяевами.

Наша работа направлена на разработку корреляционного метода, позволяющего напрямую визуализировать только события ВИЧ-инфекции. Комбинируя таким образом флуоресцентные сигналы живых клеток, такие как микроскопия, криофлуоресцентная микроскопия и криоэлектронная томография, живые клетки и криофлуоресцентные сигналы могут быть использованы для эффективного управления выборкой в криоэлектронной томографии. Кроме того, структурная информация, полученная с помощью криоэлектронной томографии, может быть дополнена динамическими функциональными данными, доступными при визуализации образа жизни флуоресцентных меченых мишеней. Основное преимущество этой техники или существующего метода заключается в том, что передовая коррелятивная высокоскоростная 3D-визуализация образа жизни с помощью 3D-электронной томографии кораллов с высоким разрешением применяется для изучения динамических событий, которые по своей природе трудно уловить, таких как взаимодействие ВИЧ первого типа и клеток-хозяев на ранней стадии инфекции.

Для подготовки сетки для калочной культуры выгрузите углеродную сторону из 200 меш R два на два кванти фольги, золотую ЭМ искатель сетки под давлением 25 миллиампер в течение 25 секунд. Покройте сетку EM нином волокна, поместив ее углеродной стороной вниз на каплю размером 40 микролитров 50 микрограммов на миллилитр раствора нина. Оставьте его в тканевом культурном колпаке под ультрафиолетовым светом на два часа для дезинфекции пластины хела клеток на сетку с плотностью от двух до 10 до четвертой клетки на миллилитр в чашке для культуры со стеклянным дном.

В DMEM с соответствующими добавками инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение примерно 18 часов до заражения ВИЧ за одну неделю до заражения ВИЧ, добавьте флуоресцентный клеточный трекер к клеткам хела в чашке для культуры со стеклянным дном и инкубируйте чашку при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы обеспечить поглощение флуоресцентного красителя. Промойте клетки PBS и добавьте 50 микролитров предварительно теплой свежей среды. Поместите чашку в камеру с живыми клетками при температуре 37 градусов Цельсия с помощью конфокального микроскопа со стреловидным полем. Так как для крио-ЭМ требуются относительно тонкие участки образца.

Выберите несколько полей, содержащих от одной до трех клеток на квадрат, с ячейками между двумя фазами митоза, когда они наиболее распределены, и сохраните эти позиции с помощью программного обеспечения NIS для будущей визуализации. Затем заражайте клетки VSVG, псевдотипизированными частицами ВИЧ-1, содержащими G-F-P-V-P-R и вирусные частицы, в нижнюю яму чашки, стараясь не нарушить электромагнитную решетку. Поскольку позиции для визуализации уже выбраны и сохранены сразу после добавления вариан, соберите покадровые высокоскоростные 3D конфокальные изображения в ранее выбранных позициях в течение 20-40 минут.

Сразу после конфокальной визуализации живых клеток поместите чашку для культуры на охлажденный льдом медный блок и перенесите его в комнату для подготовки образцов крио-ЭМ. Загрузите ЭМ-сетку на специализированный пинцет, быстро промокните остатки питательной среды фильтровальной бумагой, немедленно поместите на сетку для микролитров 15-нанометровый раствор золотых шариков, смешанный с 0,2 микронными флуоресцентными микросферами. Флуоресцентные микросферы используются для корреляции между флуоресцентными и крио-ЭМ.

Загрузите пинцет на витрификационное устройство для погружной заморозки с параметрами промокания, оптимизированными для достижения наилучших результатов. Чтобы начать процедуру криофлуоресцентной световой микроскопии, подключите сухую линию азота к рукаву, помещенному на линзу объектива, чтобы линзу было тепло и не замерзла, установите самодельный криофлуоресцентный предметный столик на инвертированный флуоресцентный световой микроскоп. Подсоедините входное отверстие жидкого азота криосного испытательного стенда к механизму под собственным давлением и поместите защитное отверстие для защиты от перелива жидкого азота в соответствующий контейнер.

Поместите замороженную сетку для гидратированных образцов в картридж с ЭМ-образцом на медном блоке и поместите сверху предварительно охлажденное С-образное кольцо, чтобы держать решетку на месте. Поместите картридж во внутреннюю камеру криоступени поиска и найдите те же вирусные частицы из данных визуализации живых клеток. Поскольку ЭМ-сетка имеет индекс, легко локализовать одну и ту же частицу на сетке как на изображениях живых клеток, так и на изображениях криофлуоресценции.

Получение криографических и флуоресцентных изображений в идентифицированных положениях в криоусловиях с помощью светового микроскопа с длинной рабочей линзой объектива. Во время криофлуоресцентной визуализации периодически проверяйте уровень жидкого азота в криосценке и заправляйте его с помощью устройства под давлением по мере необходимости, чтобы поддерживать температуру образца ниже отрицательных 170 градусов Цельсия для криоэлектронной томографии. Загрузить сетку образца в криопередаточную станцию электронного микроскопа, оснащенного полевой эмиссионной пушкой, в режиме поиска низкой дозы при увеличении 140 крат.

Определите области или квадраты сетки, в которых были получены изображения криофлуоресценции. Запишите крио-ЭМ изображение коррелированной области с малым увеличением и сохраните положение в файле стадии в режиме поиска низкой дозы при увеличении 3 500 раз. Вставьте систему поиска по апертуре объектива 100 микрон и сохраните все положения, коррелирующие с сигналами GFP, в файл второго этапа.

Настройте параметры томографии для получения серии наклона, включая диапазон угла наклона, дозу электронов, величину расфокусировки и схемы наклона. Приобретите серию наклона для всех сохраненных положений, чтобы начать эту процедуру. Настройте главное окно таким образом, чтобы можно было корректировать или следовать нескольким этапам вычислений Томо Грэхема одновременно, изменять необходимые параметры и выполнять конкретные программы, которые требуются для каждого шага обработки.

На заключительном этапе создадим полностью выровненный стек с погрешностью основной вязки менее 0,6 и реконструируем томы с помощью алгоритма взвешенной обратной проекции. В Im мод для характеристики динамического поведения вирусных частиц. Клетки Hela, инфицированные ВИЧ-1, были визуализированы с помощью высокоскоростной конфокальной микроскопии живых клеток, а движения частиц были проанализированы с помощью автоматизированного 3D-отслеживания частиц.

На этом репрезентативном рисунке одна зеленая флуоресцентная вирусная частица, обозначенная желтым наконечником стрелки, отслеживалась в 3D-конфокальных стеках с трехминутным интервалом между кадрами, чтобы избежать замедления в несколько минут. Это может произойти между получением последнего конфокального изображения живой клетки и погружением в замораживание. Был спроектирован и изготовлен столик для криофлуоресцентной световой микроскопии для визуализации замороженных гидратированных образцов в крио-картриджах.

На панели светового микроскопа А изображен человек, находящийся под давлением, наполненный жидким азотом, который используется для охлаждения медной криосной стадии образца. На панели B показан вид сверху изнутри на стадию криообразца с внутренней камерой, обозначенной белой стрелкой. Сетка образца помещается на картридж для образцов E EM, который находится в центре платформы из медных блоков, обозначенной черной стрелкой.

Эта платформа была добавлена для использования с неполярными электронными микроскопами. После загрузки сетки образца картриджи переносятся во внутреннюю камеру для подачи флуоресцентного света. На панелях для микроскопии C и D показан соответственно картридж с образцом до и после установки медного кольца для удержания сетки на месте для использования с неполярным криоэлектронным микроскопом.

Полезность процедуры расширенной корреляционной микроскопии клеток жизни и криоэлектронной томографии продемонстрирована при прямой визуализации флуоресцентно меченых частиц HIV V 1, взаимодействующих с пяточной клеткой-хозяином. На изображение DIC, записанное с помощью криосветительной микроскопии, показанное на панели А, накладывается криофлуоресцентное изображение частиц, помеченных GFP, показанное на панели В. Помеченные частицы окрашены. Красные панели C, D и E представляют собой низкодозовые крио-ЭМ изображения области, содержащей флуоресцентную частицу, обведенную на панелях B и C в точке 140 x 3, 500 x и 27 500 x соответственно.

Врезка на панели E представляет собой увеличенный вид, записанный после получения томографической наклонной серии, FG и H показывают три томографических среза толщиной четыре нанометра, разделенных расстоянием 21 нанометр в направлении Z. Соединения между частицей и мембраной хело-клеток обозначены стрелками как на проекционном изображении на врезке и панели Е, так и на томографических срезах. На панелях F и g.

Мы представили простой набор протоколов для обеспечения передового коррелятивного подхода к анализу динамических взаимодействий вирусов и стерильных клеток с использованием покадровой конфокальной флуоресцентной визуализации липоклеток с последующей криоэлектронной томографией. При проведении этой процедуры важно помнить, что точная и надежная корреляция между флуоресцентным изображением и изображением электронной микроскопии имеет решающее значение для успешного получения электронной томографии вороны. Данные, описанные в этой процедуре, будут полезны для многочисленных приложений, связанных с динамическими клеточными процессами в клеточной биологии, такими как интернализация рецепторов клеточной сигнальной поверхности.