5/6th нефрэктомии в сочетании с высоким содержанием соли и азотной ингибирование синтазы, чтобы побудить хронического заболевания почек у крыс Льюиса

Общая цель данной процедуры — индуцирование хронической болезни почек у крыс линии Lewis. Это достигается путем предварительного введения блокатора оксида азота (NG Nitro, L-аргинина или LNNA) в течение четырех недель с последующим удалением всей правой почки.

Затем, спустя одну неделю, удаляют две трети левой почки. Наконец, при одновременном применении LNNA и диеты с высоким содержанием соли, в течение определенного времени отслеживается развитие почечной недостаточности у крысы. В конечном итоге можно получить результаты, подтверждающие развитие хронической болезни почек, путем сбора мочи для измерения уровня белка и гематокрита, определения UIA в крови, плазме и/или моче, а также измерения систолического артериального давления.

Функция почек в конечном итоге определяется клиренсом инулина и пара-аминогиппуровой кислоты (PAH). Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области нефрологии, такие как более глубокое понимание патологии ХБП, и может быть использован для изучения эффекта терапевтических вмешательств. За четыре недели до проведения первой нефрэктомии начните введение ингибитора синтазы оксида азота LNNA в питьевую воду крыс в концентрации 20 mg/L.

Следуйте данному графику. Перед началом процедуры продезинфицируйте стол 70% спиртом. Для подготовки к операции простерилизуйте следующие инструменты: одну салфетку, один 12-сантиметровый анатомический пинцет с одним-двумя зубцами, один стандартный зажим типа Student, два пинцета Симкина, одни ножницы Майо, одни ирисные ножницы и один иглодержатель Олсона-Хегера с ножницами.

Затем подготовьте следующий перечень материалов и оборудования: операционный стол с греющим ковриком и лампой, кислород и изофлуран, салфетки, шейвер, стерильные хирургические инструменты, стерильную марлю размером 5х5 и 10х10, 70% спирт, 0,9% раствор хлорида натрия, шприц объемом 1 мл, иглы 25G, гемостатическую губку, шовный материал Vicryl 4.0 и 5.0, бупренорфин в дозе 0,03 мг/кг и чистую клетку для крыс на послеоперационный период.

После введения животного в состояние наркоза в индукционной камере с использованием 4% изофлурана и проведения преанальгезии, при необходимости, перенесите крысу на подогревающую подстилку на столе, уложив её на левый бок, и обеспечьте вентиляцию с помощью носового конуса, используя смесь 2% изофлурана и одного литра кислорода. Выбрейте шерсть на боку крысы и продезинфицируйте место хирургического вмешательства спиртом.

Поскольку операция проводится в полустерильных условиях, для обеспечения более стерильной подготовки мы обрабатываем кожу в области спинного гребня только спиртом. Можно использовать обработку Бетадином; наденьте шапочку и маску, затем вымойте и продезинфицируйте руки перед тем, как надеть стерильные хирургические перчатки. Далее, используя анатомический пинцет и тупоконечные ножницы, сделайте разрез длиной от 1 до 1,5 см параллельно ребрам.

Затем путем тупой диссекции мышц спины обнажите правую почку. Как только нижний полюс почки станет виден, используйте небольшие тупые пинцеты, чтобы осторожно захватить периренальную жировую ткань. Затем с помощью пинцета аккуратно потяните за периренальный жир, стараясь не задеть надпочечник, и выведите почку наружу, чтобы отделить ее от надпочечника.

Расположите пинцет в медиальной части жировой ткани и осторожно сдвиньте ткань вверх, в пространство между надпочечником и почкой. Аккуратно переложите почку на марлю, очистив ее от окружающего жира и соединительной ткани. Найдите почечную артерию и вену и осторожно их зафиксируйте.

Накложите лигатуру с одним узлом вокруг сосудов, чтобы предотвратить ее соскальзывание. После разреза осторожно переместите незатянутый узел по сосудам в сторону аорты примерно на 0,5 сантиметра, чтобы создать пространство между почкой и узлом. Затем завяжите два двойных узла, не обрезая концы лигатуры.

Если перфузия была успешно остановлена, почка немедленно приобретет коричневый цвет. Затем перережьте почечные сосуды близко к почке и извлеките её. Осторожно потяните за длинные концы лигатуры, чтобы убедиться в отсутствии кровотечения из почечных сосудов.

Лигатура должна оставаться на сосуде. Отрежьте длинные концы лигатуры. Остатки почечных сосудов втянутся в брюшную полость.

Немедленно зашейте скелетные мышцы задней конечности с помощью непрерывного шва нитью Vicryl 5.0. Внутримышечно введите бупренорфин в дозе 0.03 milligrams per kilogram. Затем зашейте кожу с помощью внутрикожных швов нитью Vicryl 4.0.

Затем промокните иссеченную почку насухо и взвесьте ее. Поместите крысу для восстановления в чистую индивидуальную клетку, расположенную наполовину на грелке, с доступом к корму и воде, и наблюдайте за ней в соответствии с текстовым протоколом. Спустя семь дней.

При подготовке ко второй операции рассчитайте массу примерно двух третей правой почки и подготовьте небольшие кусочки гелевой губки. Повторите описанную процедуру, чтобы вывести левую почку наружу и отделить от нее надпочечник. Поместите острые ножницы вокруг верхнего полюса левой почки и одним движением резектируйте верхний полюс; немедленно прикройте место разреза кусочком гелевой губки и слегка прижмите стерильной марлей.

Затем резектируйте нижний полюс почки и закройте его аналогичным образом, чтобы предотвратить свертывание крови на коже. Приподнимите почку и с помощью стерильной марли поддерживайте легкое давление на обе гемостатические губки до остановки кровотечения. Если кровотечение сохраняется в области другой губки, поместите остаток почки с прикрепленными гемостатическими губками обратно в брюшную полость, после чего ушейте мышцы и кожу.

Следуйте той же процедуре, которая была описана ранее, для мониторинга восстановления и содержания крысы. После субтотальной нефрэктомии остается примерно одна шестая часть от общей массы почек. На этом рисунке показан рассчитанный процент удаленной массы правой почки со средним значением и стандартным отклонением.

В наших предыдущих экспериментах в течение недели после односторонней нефрэктомии наблюдается гипертрофия левой почки, что приводит к некоторой недооценке предпочтительного объема удаляемой почечной ткани, который определялся на основе расчетного веса правой почки. Однако, поскольку определить вес левой почки невозможно, этот метод является наиболее точным способом удаления примерно пяти шестых массы почки. Прогрессирование почечной недостаточности отслеживается путем сбора мочи для измерения содержания белка и креатинина, анализа крови на уровень мочевины и креатинина в плазме, а также измерения систолического артериального давления.

Клиренс креатинина можно рассчитать, однако он имеет тенденцию к занижению степени снижения СКФ из-за интенсивной канальцевой секреции креатинина у крыс, что подчеркивает важность использования золотого стандарта определения функции почек по клиренсу инулина и ПАХ, полную процедуру которого описали Conners и соавторы. Клиренс инулина и ПАХ рассчитывается на основе их концентрации в пробе мочи, скорости мочеотделения и их концентрации в плазме. Со временем у крыс с хронической болезнью почек или ХБП развиваются гипертензия, анемия, протеинурия, а также значительное снижение скорости клубочковой фильтрации и эффективного почечного плазмотока.

Через шесть недель развивается стабильная ХБП, что является подходящим моментом времени для тестирования терапевтических мероприятий; при этом наблюдается выраженное прогрессирование гипертензии и протеинурии, в то время как гематокрит и функция почек демонстрируют умеренное ухудшение. Другие симптомы, которые не рассматривались в наших экспериментах, включают нарушения фосфатно-кальциевого и липидного обменов, а также многие другие, в зависимости от линии крыс. Развитие ХБП может существенно варьироваться у крыс линии Lewis, использованных в данной работе.

Для индукции гипертензии и эндотелиальной дисфункции вводили диету с высоким содержанием соли и блокатор оксида азота. Один небольшой этап. Эта процедура занимает примерно от 20 до 50 минут при правильном выполнении.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как индуцировать хроническую болезнь почек у крыс линии Loose Reds путем проведения поэтапной субтотальной нефрэктомии.