Введение в флуоресцентную микроскопию
Флуоресценция — это явление, при котором вещество поглощает свет на определенной длине волны и излучает свет на другой длине волны. Флуоресценция происходит, когда электрон, перешедший в более высокое и менее стабильное энергетическое состояние, возвращается в основное состояние, испуская фотон света. Свет, вызывающий возбуждение, или перенос электрона в состояние с более высокой энергией, имеет более короткую длину волны и более высокую энергию, чем флуоресцентное излучение, которое характеризуется большей длиной волны, меньшей энергией и другим цветом.
Флуоресцентная микроскопия сочетает в себе увеличительные свойства светового микроскопа с технологией флуоресценции, которая позволяет возбуждать и регистрировать излучение флуорофоров — флуоресцентных химических соединений. С помощью флуоресцентной микроскопии ученые могут наблюдать локализацию специфических типов клеток в тканях или молекул внутри клеток.
Основные компоненты флуоресцентного микроскопа во многом совпадают с компонентами традиционного светового микроскопа. Однако два основных отличия заключаются в типе источника света и использовании специализированных фильтрующих элементов.
Флуоресцентная микроскопия требует очень мощного источника света, такого как ксеноновая или ртутная дуговая лампа, подобная той, что показана здесь. Свет, излучаемый ртутной дуговой лампой, в 10–100 раз ярче, чем у большинства ламп накаливания, и обеспечивает освещение в широком диапазоне длин волн — от ультрафиолетового до инфракрасного. Этот мощный источник света является самой опасной частью установки флуоресцентного микроскопа, так как взгляд непосредственно на нефильтрованный свет может серьезно повредить сетчатку глаз, а неправильное обращение с лампами может привести к их взрыву.
Принцип работы флуоресцентной микроскопии прост. Свет, выходящий из дуговой лампы, проходит через возбуждающий фильтр, который отбирает длину волны возбуждения.
Этот свет отражается в сторону образца специальным зеркалом, называемым дихроичным зеркалом, которое предназначено для отражения света только на длине волны возбуждения. Отраженный свет проходит через объектив, где он фокусируется на флуоресцентном объекте. Излучение от объекта, в свою очередь, проходит обратно через объектив, где происходит увеличение изображения, а затем через дихроичное зеркало.
Этот свет фильтруется барьерным фильтром, который отбирает длину волны эмиссии и отсекает посторонний свет от дуговой лампы или других источников, отражающийся от компонентов микроскопа. Наконец, отфильтрованное флуоресцентное излучение направляется на детектор для оцифровки изображения или передается в окуляр для визуального наблюдения.
Возбуждающий фильтр, дихроичное зеркало и барьерный фильтр могут быть объединены в один компонент, известный как фильтр-куб. При наблюдении образца можно менять фильтр-кубы для изменения длины волны возбуждения, а серия диафрагм может быть использована для регулировки интенсивности возбуждения.
При проведении флуоресцентной микроскопии выбор флуорофора может быть столь же важен, как и сам микроскоп; тип используемого флуорофора определяет длину волны возбуждения и длину волны детектируемой эмиссии. Длины волн возбуждения охватывают узкий диапазон энергий, которые могут поглощаться флуорофором, переводя его в возбужденное состояние. После возбуждения возможен широкий спектр эмиссий, или переходов обратно в низкоэнергетическое состояние, что приводит к формированию спектра эмиссии.
Разница между пиком кривой поглощения (возбуждения) и пиком кривой эмиссии известна как стоксов сдвиг. Чем больше величина этого сдвига, тем легче разделить две различные длины волн. Кроме того, любые перекрывающиеся спектры должны быть удалены компонентами фильтр-куба для снижения фона и улучшения качества изображения.
Длительное воздействие возбуждающего света на флуорофор вызывает его фотовыцветание, что проявляется в ослаблении или полной потере флуоресценции. Чтобы уменьшить фотовыцветание, можно добавить на предметное стекло антифейдинговую среду для заключения препарата и запечатать края лаком для ногтей. Кроме того, предметное стекло следует хранить в темноте, когда оно не используется для съемки.
Для начала флуоресцентной визуализации включите ксеноновый или ртутный источник света и дайте ему прогреться в течение 15 минут для достижения стабильной интенсивности освещения.
Затем поместите образец на предметный столик и зафиксируйте его. После этого включите источник белого света микроскопа. Сфокусируйтесь на образце, используя объектив с наименьшим увеличением, регулируя ручки грубой и точной фокусировки. Затем с помощью винтов перемещения столика найдите интересующую вас область.
Далее выключите источник белого света, а также любой ненужный комнатный свет для уменьшения фона.
Выберите соответствующий фильтр-куб для красителя, который вы визуализируете, и откройте затвор, чтобы осветить образец.
Наконец, выполните точную фокусировку и направьте световой поток на камеру. Вероятно, вам потребуется отрегулировать время экспозиции для каждого используемого флуорофора или флуоресцентного красителя. Однако важно сохранять время экспозиции постоянным при сравнении характеристик одного и того же красителя на разных образцах.
Для визуализации нескольких красителей в одном образце меняйте фильтр-куб в соответствии с каждым флуорофором и записывайте каждое новое изображение.
После визуализации всех красителей в образце отдельные изображения можно наложить друг на друга и объединить.
Множество различных типов экспериментов могут использовать флуоресцентную микроскопию и задействовать разные виды флуорофоров. Одно из наиболее распространенных применений флуоресцентной микроскопии — визуализация белков, меченных антителами, которые присоединены или «конъюгированы» с флуоресцентными соединениями. В данном случае антитело к поверхностным белкам лептоспир была обнаружена с помощью вторичного антитела, конъюгированного с alexafluor-488, которое при возбуждении флуоресцирует зеленым цветом.
Другим способом выделить определенную структуру с помощью флуоресценции является интеграция кода флуоресцентного белка, такого как зеленый флуоресцентный белок, или GFP, в ДНК организма. Ген GFP был изначально выделен из медузы и может экспрессироваться, то есть вырабатываться, культивируемыми клетками в ответ на специфические триггеры или как часть определенного типа клеток, например, опухолевых клеток, которые светятся на этом изображении.
Еще одним применением флуоресцентной визуализации является флуоресцентная спекл-микроскопия — технология, в которой используются флуоресцентно меченные макромолекулярные ансамбли, такие как сеть F-актина, представленная здесь, для изучения движения и кинетики обновления этого важного белка цитоскелета.
Сложный метод, известный как восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания, или FRAP, заключается в преднамеренном фотообесцвечивании небольшого участка образца для мониторинга скорости диффузии флуоресцентно меченных молекул обратно в область фотообесцвечивания.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по флуоресцентной микроскопии.
В этом видео мы изучили концепцию флуоресценции, определили отличия флуоресцентной микроскопии от световой микроскопии и узнали, как получать флуоресцентные изображения с помощью микроскопа. Мы также ознакомились с некоторыми базовыми и продвинутыми методами применения флуоресценции. Спасибо за просмотр и помните: хотя фотоотбеливание выглядит отлично для ваших зубов, оно крайне вредно для ваших образцов.
Флуоресцентная микроскопия представляет собой мощный аналитический инструмент, который сочетает в себе увеличительные свойства световой микроскопии с…
Флуоресценция — это явление, при котором вещество поглощает свет на определенной длине волны и излучает свет на другой длине волны. Флуоресценция происходит, когда электрон, перешедший в более высокое и менее стабильное энергетическое состояние, возвращается в основное состояние, испуская фотон света. Свет, вызывающий возбуждение, или перенос электрона в состояние с более высокой энергией, имеет более короткую длину волны и более высокую энергию, чем флуоресцентное излучение, которое характеризуется большей длиной волны, меньшей энергией и другим цветом.
Флуоресцентная микроскопия сочетает в себе увеличительные свойства светового микроскопа с технологией флуоресценции, которая позволяет возбуждать и регистрировать излучение флуорофоров — флуоресцентных химических соединений. С помощью флуоресцентной микроскопии ученые могут наблюдать локализацию специфических типов клеток в тканях или молекул внутри клеток.
Основные компоненты флуоресцентного микроскопа во многом совпадают с компонентами традиционного светового микроскопа. Однако два основных отличия заключаются в типе источника света и использовании специализированных фильтрующих элементов.
Флуоресцентная микроскопия требует очень мощного источника света, такого как ксеноновая или ртутная дуговая лампа, подобная той, что показана здесь. Свет, излучаемый ртутной дуговой лампой, в 10–100 раз ярче, чем у большинства ламп накаливания, и обеспечивает освещение в широком диапазоне длин волн — от ультрафиолетового до инфракрасного. Этот мощный источник света является самой опасной частью установки флуоресцентного микроскопа, так как взгляд непосредственно на нефильтрованный свет может серьезно повредить сетчатку глаз, а неправильное обращение с лампами может привести к их взрыву.
Принцип работы флуоресцентной микроскопии прост. Свет, выходящий из дуговой лампы, проходит через возбуждающий фильтр, который отбирает длину волны возбуждения.
Этот свет отражается в сторону образца специальным зеркалом, называемым дихроичным зеркалом, которое предназначено для отражения света только на длине волны возбуждения. Отраженный свет проходит через объектив, где он фокусируется на флуоресцентном объекте. Излучение от объекта, в свою очередь, проходит обратно через объектив, где происходит увеличение изображения, а затем через дихроичное зеркало.
Этот свет фильтруется барьерным фильтром, который отбирает длину волны эмиссии и отсекает посторонний свет от дуговой лампы или других источников, отражающийся от компонентов микроскопа. Наконец, отфильтрованное флуоресцентное излучение направляется на детектор для оцифровки изображения или передается в окуляр для визуального наблюдения.
Возбуждающий фильтр, дихроичное зеркало и барьерный фильтр могут быть объединены в один компонент, известный как фильтр-куб. При наблюдении образца можно менять фильтр-кубы для изменения длины волны возбуждения, а серия диафрагм может быть использована для регулировки интенсивности возбуждения.
При проведении флуоресцентной микроскопии выбор флуорофора может быть столь же важен, как и сам микроскоп; тип используемого флуорофора определяет длину волны возбуждения и длину волны детектируемой эмиссии. Длины волн возбуждения охватывают узкий диапазон энергий, которые могут поглощаться флуорофором, переводя его в возбужденное состояние. После возбуждения возможен широкий спектр эмиссий, или переходов обратно в низкоэнергетическое состояние, что приводит к формированию спектра эмиссии.
Разница между пиком кривой поглощения (возбуждения) и пиком кривой эмиссии известна как стоксов сдвиг. Чем больше величина этого сдвига, тем легче разделить две различные длины волн. Кроме того, любые перекрывающиеся спектры должны быть удалены компонентами фильтр-куба для снижения фона и улучшения качества изображения.
Длительное воздействие возбуждающего света на флуорофор вызывает его фотовыцветание, что проявляется в ослаблении или полной потере флуоресценции. Чтобы уменьшить фотовыцветание, можно добавить на предметное стекло антифейдинговую среду для заключения препарата и запечатать края лаком для ногтей. Кроме того, предметное стекло следует хранить в темноте, когда оно не используется для съемки.
Для начала флуоресцентной визуализации включите ксеноновый или ртутный источник света и дайте ему прогреться в течение 15 минут для достижения стабильной интенсивности освещения.
Затем поместите образец на предметный столик и зафиксируйте его. После этого включите источник белого света микроскопа. Сфокусируйтесь на образце, используя объектив с наименьшим увеличением, регулируя ручки грубой и точной фокусировки. Затем с помощью винтов перемещения столика найдите интересующую вас область.
Далее выключите источник белого света, а также любой ненужный комнатный свет для уменьшения фона.
Выберите соответствующий фильтр-куб для красителя, который вы визуализируете, и откройте затвор, чтобы осветить образец.
Наконец, выполните точную фокусировку и направьте световой поток на камеру. Вероятно, вам потребуется отрегулировать время экспозиции для каждого используемого флуорофора или флуоресцентного красителя. Однако важно сохранять время экспозиции постоянным при сравнении характеристик одного и того же красителя на разных образцах.
Для визуализации нескольких красителей в одном образце меняйте фильтр-куб в соответствии с каждым флуорофором и записывайте каждое новое изображение.
После визуализации всех красителей в образце отдельные изображения можно наложить друг на друга и объединить.
Множество различных типов экспериментов могут использовать флуоресцентную микроскопию и задействовать разные виды флуорофоров. Одно из наиболее распространенных применений флуоресцентной микроскопии — визуализация белков, меченных антителами, которые присоединены или «конъюгированы» с флуоресцентными соединениями. В данном случае антитело к поверхностным белкам лептоспир была обнаружена с помощью вторичного антитела, конъюгированного с alexafluor-488, которое при возбуждении флуоресцирует зеленым цветом.
Другим способом выделить определенную структуру с помощью флуоресценции является интеграция кода флуоресцентного белка, такого как зеленый флуоресцентный белок, или GFP, в ДНК организма. Ген GFP был изначально выделен из медузы и может экспрессироваться, то есть вырабатываться, культивируемыми клетками в ответ на специфические триггеры или как часть определенного типа клеток, например, опухолевых клеток, которые светятся на этом изображении.
Еще одним применением флуоресцентной визуализации является флуоресцентная спекл-микроскопия — технология, в которой используются флуоресцентно меченные макромолекулярные ансамбли, такие как сеть F-актина, представленная здесь, для изучения движения и кинетики обновления этого важного белка цитоскелета.
Сложный метод, известный как восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания, или FRAP, заключается в преднамеренном фотообесцвечивании небольшого участка образца для мониторинга скорости диффузии флуоресцентно меченных молекул обратно в область фотообесцвечивания.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по флуоресцентной микроскопии.
В этом видео мы изучили концепцию флуоресценции, определили отличия флуоресцентной микроскопии от световой микроскопии и узнали, как получать флуоресцентные изображения с помощью микроскопа. Мы также ознакомились с некоторыми базовыми и продвинутыми методами применения флуоресценции. Спасибо за просмотр и помните: хотя фотоотбеливание выглядит отлично для ваших зубов, оно крайне вредно для ваших образцов.
Флуоресценция — это явление, при котором вещество поглощает свет на определенной длине волны и излучает свет на другой длине волны. Флуоресценция происходит, когда электрон, перешедший в более высокое и менее стабильное энергетическое состояние, возвращается в основное состояние, испуская фотон света. Свет, вызывающий возбуждение, или перенос электрона в состояние с более высокой энергией, имеет более короткую длину волны и более высокую энергию, чем флуоресцентное излучение, которое характеризуется большей длиной волны, меньшей энергией и другим цветом.
Флуоресцентная микроскопия сочетает в себе увеличительные свойства светового микроскопа с технологией флуоресценции, которая позволяет возбуждать и регистрировать излучение флуорофоров — флуоресцентных химических соединений. С помощью флуоресцентной микроскопии ученые могут наблюдать локализацию специфических типов клеток в тканях или молекул внутри клеток.
Основные компоненты флуоресцентного микроскопа во многом совпадают с компонентами традиционного светового микроскопа. Однако два основных отличия заключаются в типе источника света и использовании специализированных фильтрующих элементов.
Флуоресцентная микроскопия требует очень мощного источника света, такого как ксеноновая или ртутная дуговая лампа, подобная той, что показана здесь. Свет, излучаемый ртутной дуговой лампой, в 10–100 раз ярче, чем у большинства ламп накаливания, и обеспечивает освещение в широком диапазоне длин волн — от ультрафиолетового до инфракрасного. Этот мощный источник света является самой опасной частью установки флуоресцентного микроскопа, так как взгляд непосредственно на нефильтрованный свет может серьезно повредить сетчатку глаз, а неправильное обращение с лампами может привести к их взрыву.
Принцип работы флуоресцентной микроскопии прост. Свет, выходящий из дуговой лампы, проходит через возбуждающий фильтр, который отбирает длину волны возбуждения.
Этот свет отражается в сторону образца специальным зеркалом, называемым дихроичным зеркалом, которое предназначено для отражения света только на длине волны возбуждения. Отраженный свет проходит через объектив, где он фокусируется на флуоресцентном объекте. Излучение от объекта, в свою очередь, проходит обратно через объектив, где происходит увеличение изображения, а затем через дихроичное зеркало.
Этот свет фильтруется барьерным фильтром, который отбирает длину волны эмиссии и отсекает посторонний свет от дуговой лампы или других источников, отражающийся от компонентов микроскопа. Наконец, отфильтрованное флуоресцентное излучение направляется на детектор для оцифровки изображения или передается в окуляр для визуального наблюдения.
Возбуждающий фильтр, дихроичное зеркало и барьерный фильтр могут быть объединены в один компонент, известный как фильтр-куб. При наблюдении образца можно менять фильтр-кубы для изменения длины волны возбуждения, а серия диафрагм может быть использована для регулировки интенсивности возбуждения.
При проведении флуоресцентной микроскопии выбор флуорофора может быть столь же важен, как и сам микроскоп; тип используемого флуорофора определяет длину волны возбуждения и длину волны детектируемой эмиссии. Длины волн возбуждения охватывают узкий диапазон энергий, которые могут поглощаться флуорофором, переводя его в возбужденное состояние. После возбуждения возможен широкий спектр эмиссий, или переходов обратно в низкоэнергетическое состояние, что приводит к формированию спектра эмиссии.
Разница между пиком кривой поглощения (возбуждения) и пиком кривой эмиссии известна как стоксов сдвиг. Чем больше величина этого сдвига, тем легче разделить две различные длины волн. Кроме того, любые перекрывающиеся спектры должны быть удалены компонентами фильтр-куба для снижения фона и улучшения качества изображения.
Длительное воздействие возбуждающего света на флуорофор вызывает его фотовыцветание, что проявляется в ослаблении или полной потере флуоресценции. Чтобы уменьшить фотовыцветание, можно добавить на предметное стекло антифейдинговую среду для заключения препарата и запечатать края лаком для ногтей. Кроме того, предметное стекло следует хранить в темноте, когда оно не используется для съемки.
Для начала флуоресцентной визуализации включите ксеноновый или ртутный источник света и дайте ему прогреться в течение 15 минут для достижения стабильной интенсивности освещения.
Затем поместите образец на предметный столик и зафиксируйте его. После этого включите источник белого света микроскопа. Сфокусируйтесь на образце, используя объектив с наименьшим увеличением, регулируя ручки грубой и точной фокусировки. Затем с помощью винтов перемещения столика найдите интересующую вас область.
Далее выключите источник белого света, а также любой ненужный комнатный свет для уменьшения фона.
Выберите соответствующий фильтр-куб для красителя, который вы визуализируете, и откройте затвор, чтобы осветить образец.
Наконец, выполните точную фокусировку и направьте световой поток на камеру. Вероятно, вам потребуется отрегулировать время экспозиции для каждого используемого флуорофора или флуоресцентного красителя. Однако важно сохранять время экспозиции постоянным при сравнении характеристик одного и того же красителя на разных образцах.
Для визуализации нескольких красителей в одном образце меняйте фильтр-куб в соответствии с каждым флуорофором и записывайте каждое новое изображение.
После визуализации всех красителей в образце отдельные изображения можно наложить друг на друга и объединить.
Множество различных типов экспериментов могут использовать флуоресцентную микроскопию и задействовать разные виды флуорофоров. Одно из наиболее распространенных применений флуоресцентной микроскопии — визуализация белков, меченных антителами, которые присоединены или «конъюгированы» с флуоресцентными соединениями. В данном случае антитело к поверхностным белкам лептоспир была обнаружена с помощью вторичного антитела, конъюгированного с alexafluor-488, которое при возбуждении флуоресцирует зеленым цветом.
Другим способом выделить определенную структуру с помощью флуоресценции является интеграция кода флуоресцентного белка, такого как зеленый флуоресцентный белок, или GFP, в ДНК организма. Ген GFP был изначально выделен из медузы и может экспрессироваться, то есть вырабатываться, культивируемыми клетками в ответ на специфические триггеры или как часть определенного типа клеток, например, опухолевых клеток, которые светятся на этом изображении.
Еще одним применением флуоресцентной визуализации является флуоресцентная спекл-микроскопия — технология, в которой используются флуоресцентно меченные макромолекулярные ансамбли, такие как сеть F-актина, представленная здесь, для изучения движения и кинетики обновления этого важного белка цитоскелета.
Сложный метод, известный как восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания, или FRAP, заключается в преднамеренном фотообесцвечивании небольшого участка образца для мониторинга скорости диффузии флуоресцентно меченных молекул обратно в область фотообесцвечивания.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по флуоресцентной микроскопии.
В этом видео мы изучили концепцию флуоресценции, определили отличия флуоресцентной микроскопии от световой микроскопии и узнали, как получать флуоресцентные изображения с помощью микроскопа. Мы также ознакомились с некоторыми базовыми и продвинутыми методами применения флуоресценции. Спасибо за просмотр и помните: хотя фотоотбеливание выглядит отлично для ваших зубов, оно крайне вредно для ваших образцов.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is fluorescence and how does it occur at the molecular level?
Fluorescence occurs when a fluorophore absorbs light at a specific wavelength, exciting an electron to a higher energy state. As the electron relaxes back to its ground state, it emits a photon of light at a longer wavelength and lower energy than the absorbed light. This emission enables visualization of fluorescently labeled structures in microscopy applications.
Q2: How does fluorescence microscopy differ from light microscopy?
Fluorescence microscopy combines magnification with fluorescence detection, requiring specialized components beyond traditional light microscopy. Key differences include a powerful xenon or mercury arc lamp that is 10-100 times brighter than incandescent sources, specialized exciter and barrier filters, and a dichroic mirror to separate excitation and emission wavelengths. These additions enable detection of fluorescently labeled molecules within cells and tissues.
Q3: What is Stokes Shift and why does it matter in fluorescence microscopy?
Stokes Shift is the difference between the peak absorption wavelength and the peak emission wavelength of a fluorophore. A larger Stokes Shift makes it easier to separate excitation and emission wavelengths using filters, reducing background noise and improving image quality. This separation is critical for obtaining clear fluorescent images without contaminating light from the microscope components.
Q4: What causes photobleaching and how can you prevent it?
Photobleaching occurs when prolonged excitation weakens or eliminates a fluorophore's ability to fluoresce. To reduce photobleaching, add anti-fade mounting medium to slides and seal edges with nail polish. Additionally, keep slides in the dark when not being imaged to minimize unnecessary light exposure and preserve fluorescence intensity for accurate imaging.
Q5: What are the main components of a fluorescence microscope and their functions?
The exciter filter selects the excitation wavelength, the dichroic mirror reflects excitation light toward the sample while allowing emission light to pass through, and the barrier filter selects emission wavelength while blocking contaminating light. These three components can be assembled into a filter cube, which can be changed during imaging to accommodate different fluorophores and their specific wavelength requirements.
Q6: How do you prepare and image a fluorescence microscopy sample?
Allow the xenon or mercury light source to warm up for 15 minutes to reach constant illumination. Place the sample on the stage and focus using the lowest objective. Turn off room lights to reduce background, select the appropriate filter cube for your fluorophore, and open the shutter to illuminate the sample. Adjust exposure time as needed, keeping it constant when comparing samples with the same dye.
Q7: What are common methods for labeling samples in fluorescence microscopy?
Common labeling methods include conjugating fluorescent compounds to antibodies that target specific proteins, integrating fluorescent protein genes like GFP into organism DNA for expression in specific cell types, and labeling macromolecular assemblies such as the F-actin cytoskeletal network. Each method enables visualization of different cellular structures and molecular components for research and diagnostic applications.
Главы в этом видео
0:00
Introduction to Fluorescence Microscopy
1:19
Principles and Components of the Fluorescent Microscope
2:21
Basic Principles of Fluorescence Microscopy
5:25
Fluorescence Microscopy Imaging
6:59
Applications
8:45
Summary