Реализация динамического Хомут с Synaptic и искусственного проводимости в мыши ганглиозных клеток сетчатки

Общая цель данного эксперимента заключается в изучении влияния изменений в соотношении и относительном времени возбуждающих и тормозных синаптических входов на спайковую активность нейронов с использованием ганглиозных клеток сетчатки в качестве модельных нейронов. Это достигается путем заплатки клеточного тела ганглиозной клетки в целую сетчатку, с помощью стеклянной пипетки, наполненной внутриклеточным раствором, напоминающим физиологический ионный состав и желтый люцифер для морфологической идентификации типа клетки в качестве второго шага с помощью динамического зажима, в тело клетки вводится набор возбуждающих и тормозящих форм волны проводимости, которые вызывают изменение мембранного потенциала в качестве ответной реакции. Далее в тело клетки вводятся различные формы волн проводимости, полученные в результате физиологических экспериментов в контрольных условиях, или в присутствии лекарственных препаратов с целью получения соответствующих нейронных реакций.

Результаты показывают влияние изменений соотношения возбуждения и торможения на спайковую активность ганглиозных клеток сетчатки на основе инжекции токов, состоящих из возбуждающих и тормозных проводимостей, посредством динамических зажимных записей. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как токовый клещ или электрический зажим, заключается в том, что он предоставляет интерактивный инструмент, с помощью которого отношение и относительное время возбуждающих и тормозных синаптических проводимостей могут быть введены в нейроны для исследования влияния на клеточные реакции. Эта методология может дать представление о функции цепей сетчатки, а также любых других нейронных сетей в центральной нервной системе.

Начните эту процедуру с настройки реперфузионной системы с 250 миллилитрами карбоксиоксигенированной целевой среды в электрофизиологической установке. Далее равномерно нанесите тонкий слой вакуумной смазки на дно перфузионной камеры. Закройте его крышкой и убедитесь, что он герметичный.

Затем нанесите небольшое количество смазки на верхний и нижний торцы камеры. Смазка будет удерживать сетку на месте и предотвращать ее слишком сильное давление на сетчатку. Теперь закрепите камеру на платформе и после этого совместите оба отверстия.

Принесите животное в жертву при вывихе шейки матки после обезболивания изофтором. Быстро удалите его глаза с помощью небольших изогнутых ножниц. Тщательно вымойте их с помощью кислородной внеклеточной жидкости в небольшом стакане и поместите в чашку Петри, наполненную кислородной внеклеточной жидкостью.

Под рассекающим микроскопом сделайте отверстие для введения с помощью иглы 19 калибра в роговице примерно в двух миллиметрах от края на обоих глазах. Этот важный шаг должен быть быстрым, чтобы обеспечить насыщение кислородом обоих поводьев. После этого удалите одну роговицу небольшими ножницами для радужной оболочки, разрезая параллельно ее краю.

Затем удалите радужную оболочку и хрусталик с помощью пары тонких щипцов и повторите процедуры для другого глаза. Переложите один наглазник в стакан, содержащий кислородированный внеклеточный раствор в автомобильной коробке. Лезвием скальпеля разрежьте один наглазник пополам, аккуратно отделите сетчатку от пигментного эпителия с помощью тупого рассекающего зонда или аккуратно оттянув его.

Затем удерживайте край отслоившейся ткани сетчатки рядом с аурой Серта парой тонких щипцов и захватите ауру Серта еще одной парой тонких щипцов. Потяните его к центру сетчатки. Это деликатный процесс, который может занять несколько попыток.

При успешной ауре серты будет удалено цилиарное тело и стекловидное тело, а кривизна сетчатки уменьшится. Далее обрежьте края и затем перенесите сетчатку в перфузионную камеру ганглиозными клетками вверх. Удерживайте салфетку на месте, поместив сетку на шарики для смазки.

Сохраните оставшуюся ткань с помощью другого наглазника в коробке с кислородом внеклеточным раствором для последующего использования, смонтируйте записывающую камеру под вертикальным микроскопом. Немедленно отрегулируйте непрерывную перфузию сетчатки с помощью кислородного внеклеточного раствора carbox со скоростью от трех до пяти миллилитров в минуту при температуре 35,5 градусов Цельсия, убедитесь, что заземляющий электрод на месте. Теперь включите источник света микроскопа и сфокусируйте его на клеточных телах ганглиозных клеток через объектив в 40 раз.

Найдите центр крепления отверстия для записи. На этом этапе зафиксируйте стеклянную пипетку с сопротивлением от пяти до восьми мегаом в держателе и переместите ее под микроскоп с помощью микромического манипулятора под объективом 40-кратного увеличения. Медленно опускайте пипетку до тех пор, пока она не сделает небольшую ямочку на поверхности внутренней ограничивающей мембраны.

Осторожно продвигайте пипетку вперед, пока она не захватит небольшое количество ткани, а затем двигайте ее вверх или в стороны, чтобы прорвать небольшое отверстие, чтобы обнажить клеточные тела ганглиозных клеток. Теперь наполните чистую пипетку от восьми до 10 микролитров внутриклеточным раствором на основе калия с желтым люцифером. Вставьте его в держатель, прикрепленный к головному столику усилителя, и убедитесь, что хлорированный электрод из хлорированного хлорида серебра погружен в воду.

Выберите ячейку с большим телом клетки. Медленно опустите наконечник пипетки с положительным давлением, чтобы сделать небольшую ямочку на поверхности мембраны. Затем остановитесь и сбросьте давление, чтобы получить гига-уплотнение.

Как только гига-уплотнение будет достигнуто, осторожно приложите отрицательное давление, чтобы разорвать мембрану, чтобы получить конфигурацию зажима для всей ячейки. Эта процедура является деликатным шагом. Если давление оказывается слишком большим, соединение становится негерметичным.

Если их слишком мало, мембрана остается неповрежденной. Со временем желтый цвет Люцифера заполнит клетку, что позволит визуализировать морфологию клетки, если она стабильна. Эта настройка должна длиться 30 минут или больше.

Теперь проведите тест напряжения тока от минус 75 милливольт до положительных 35 милливольт каждые 10 милливольт с помощью патч-мастера и перейдите к более поздним тестам. Только при наличии натриевого тока больше одного наноампера. Затем откройте лабораторный вид и выполните специально написанную программу neuro acuma.

Установите число повтора на восемь. Затем установите реверсивные потенциалы возбуждающей и тормозной проводимости на уровне ноль и минус 75 милливольт соответственно. Выберите одну подходящую пару возбуждающих и тормозных проводимостей для тестирования, и зеленая трасса возбуждающей проводимости и красная кривая тормозящей проводимости появятся на нижней панели.

После этого вернитесь в патч-мастер и выберите текущий режим зажима. Немедленно переключите усилитель в режим токовых зажимов в neuro acuma. Нажмите кнопку записи.

Клеточный ответ с афазическим всплеском потенциалов действия появится на верхней панели. Затем введите в ячейку ток с низкой проводимостью. Во-первых, если реакция слаба или отсутствует вовсе, увеличивайте ток небольшими шагами до тех пор, пока он не вызовет сильную реакцию.

Чрезмерная инжекция тока может убить клетку. Как только испытания будут завершены. Выберите новую пару осциллограмм проводимости и повторите процедуры для всех пар физиологической и искусственной проводимости.

После записи осторожно втяните пипетку, чтобы тело клетки осталось неповрежденным. После этого немедленно зафиксируйте ткань и 4% параформальдегида на 30 минут, после чего последует три 10-минутных промывки 0,1 молярным фосфатным буфером, охладите и выполните окрашивание антителами на следующий день или в течение недели, когда будете готовы. Окрашивание против заполненных желтым Люцифером ганглиозных клеток при комнатной температуре первичным антилюциферным желтым кроличьим IgG в разведении от одного до 10 000 в течение пяти дней.

Затем на шестой день, оставшись на ночь со вторичным козьим антикроличьим IgG, добавьте разведение от одного до 500 В конце влажный монтаж сетчатки в флуоресцентную среду, сохраняющую флуоресцентную среду. Установите крышку на крышку и закройте ее лаком для ногтей. Сделайте конфокальные изображения морфологии клеток с помощью конфокального микроскопа Leica SPECT two.

Вот реакции ганглиозной клетки на инъекцию возбуждающих и тормозящих проводимости волновых форм, полученных в контрольных экспериментах, обозначенных зеленым и красным цветами соответственно. А вот реакция на инъекцию волны проводимости, записанная после применения тетродатоксина в ванне. Вот реакция другой ганглиозной клетки на различные пары волн проводимости.

Отношения между возбуждающей проводимостью и тормозной проводимостью были изменены с единицы до нуля до единицы к двум. По мере увеличения степени торможения реакция клетки уменьшалась, и вот ответы ганглиозной клетки на тот же уровень возбуждения, при котором варьировалось начало торможения. Delta T представляет собой разницу во времени между началом тормозной и возбуждающей проводимости.

По мере того как задержка торможения уменьшалась, реакция клетки становилась слабее. Эта процедура является мощным методом, который помогает выявить взаимодействие между exci three и тормозящим входом синапа, который генерирует нейронный выход.