Механическое раздражение индуцированных кальция Распространение волн в монослоев клеток: Пример бычьего эндотелиальных клеток роговицы

Общая цель следующего эксперимента заключается в изучении межклеточной коммуникации через щелевые каналы и ГЕМИ-каналы путем количественной оценки распространения межклеточной кальциевой волны, вызванной механической стимуляцией в монослоях первичных эндотелиальных клеток роговицы. Для этого сначала выделяют первичные эндотелиальные клетки роговицы из свежих бычьих глаз. На втором этапе, через два-три дня после посева на камерные предметные стекла, конфлюэнтный монослой клеток нагружают флуоресцентным кальций-чувствительным красителем flu O 4:00 AM. Затем к одной отдельной клетке монослоя прикладывают контролируемый локальный механический стимул для вызова межклеточной кальциевой волны, которую визуализируют с помощью конфокального микроскопа.

Результаты демонстрируют распространение межклеточных волн кальция. В конечном итоге ингибирование щелевых контактов и гемиканалов используется для изучения свойств и регуляции различных изоформ коннексинов и паннексинов, формирующих щелевые контакты и гемиканалы. Основным преимуществом распространения межклеточных волн кальция, индуцированных механической стимуляцией, является то, что этот метод обеспечивает простой и надежный неинвазивный способ изучения вклада и свойств соединяющих и сопрягающих каналов.

Кроме того, данный метод опирается на физиологические сигнальные молекулы и каскады, присутствующие в исследуемых клеточных системах. Наконец, он легко адаптируется к различным клеточным системам, включая первичные клетки и клеточные модели, в которых эктопически экспрессируются определенные изоформы коннексинов или PanIN. Эти методы позволяют изучить функцию и динамическую регуляцию щелевых каналов и гемиканалов на основе коннексинов и PanIN с помощью siRNA-опосредованного нокдауна эндогенных изоформ коннексинов или PanIN, а также с использованием селективных ингибиторов щелевых каналов и гемиканалов.

Данная система определенно не ограничивается только клетками эндотелия роговицы. Она adaptable практически к любому типу клеток, а также к более сложным тканям. В данной процедуре используется свежеизвлеченный глаз коровы в возрасте не более 18 месяцев, полученный не позднее чем через пять минут после смерти животного.

Образцы транспортировали в лабораторию в сбалансированном солевом растворе Эрла с добавлением 1% раствора йода при температуре четырех градусов Цельсия. Сначала перенесите глаз в чашку Петри размером 100 мм на 20 мм. Затем промойте глаз раствором EBSS, содержащим 1% йода.

Затем, начиная с этого момента, стерилизуйте его раствором 70% ethanol. Работайте в стерильном ламинарном шкафу. Осторожно вырежьте роговицу из глаза и поместите ее в чашку Петри размером 35 мм на 10 мм с EBSS слоем эпителиальных клеток вверх.

Осторожно удалите все оставшиеся ткани радужки, прикрепленные к роговице. При необходимости перенесите роговицу в другую чашку с EBSS слоем эндотелиальных клеток вверх, а затем дважды промойте EBSS. Затем поместите роговицу в песочные часы слоем эндотелия вверх и залейте питательной средой.

Для промывки удалите среду с помощью аспирационной пипетки. Нанесите 300 µL раствора трипсина в концентрации 0,5 г/л на эндотелиальный слой роговицы. Поместите песочные часы с роговицей в закрытую чашку Петри и перенесите в инкубатор на 30 минут при 37 °C и 5% CO2.

После извлечения песочных часов осторожно соскребите эндотелиальные клетки с роговицы с помощью стеклянной пастернажной пипетки с огнеполированным крючком на конце. Аспирируйте раствор, содержащий эндотелиальные клетки, и перенесите его в культуральный флакон объемом 25 см², содержащий 4 мл культуральной среды. Затем нанесите на роговицу 300 µL ростовой среды.

Повторите процедуру соскоба и перенесите раствор, содержащий эндотелиальные клетки, в культуральный флакон. Повторите этот шаг еще раз, затем поместите культуральные флаконы с эндотелиальными клетками роговицы в ростовой среде в инкубатор при 37 °C и 5% carbon dioxide. Через два дня добавьте 6 mL культуральной среды и обновляйте ростовую среду каждые два дня.

Клетки должны достичь конфлюэнтности в течение семи-десяти дней после выделения до момента пассирования. Сначала аспирируйте культуральную среду, затем дважды промойте клетки раствором EBSS. После этого добавьте к клеткам два миллилитра раствора трипсина и поместите флакон в инкубатор на три-четыре минуты.

Затем добавьте 12 milliliters питательной среды и трижды пропипетируйте ее для диспергирования клеток. Затем подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток. Перенесите по 165, 000 клеток на два культуральных предметных стекла с лунками.

Затем подготовьте квадратные культуральные флаконы объемом 75 см² для нового пассажа при плотности 6 250 клеток на см², добавьте свежую культуральную среду до общего объема 25 мл и поместите флаконы и предметные стекла с камерами в инкубатор. Среду обновляют каждые два дня; конфлюэнтность клеточного слоя должна быть достигнута в течение трех-четырех дней. Сначала загрузите клетки в предметном стекле с камерой с 10 µM Fluo-4 AM в фосфатно-солевом буферном растворе на 30 минут при 37 °C при осторожном встряхивании; пока клетки инкубируются с Fluo-4 AM, закрепите стеклянную микропипетку с диаметром кончика менее 1 мкм в нанопозиционере Pizo Electro Crystals и подключите ее к усилителю, установленному на микроманипуляторе.

Установите напряжение на нанопозиционере в диапазоне от 0,2 до 1,5 В. Удалите раствор 4:00 AM. Затем пять раз промойте клетки фосфатно-солевым буфером, после чего инкубируйте клетки в PBS в течение не менее пяти минут при комнатной температуре перед проведением измерений.

Возбуждение при 488 нанометрах осуществлялось с помощью аргонового лазера и светоделителя HFT 48. Сбор флуоресцентного излучения при 530 нанометрах проводился с использованием длинноволнового фильтра пропускания LP 5 0 5 с установленной минимальной апертурой диафрагмы; в данном случае использовался объектив с масляной иммерсией 40 x. Поместите камерный слайд на предметный столик конфокального микроскопа и найдите область с конфлуэнтными клетками.

Затем переместите микроманипулятор так, чтобы стекричная микропипетка касалась мембраны клетки под углом 45 градусов. С помощью микроманипулятора кратковременно коснитесь стекричной микропипеткой участка мембраны одиночной клетки площадью менее 1%, чтобы вызвать односекундную механическую стимуляцию клетки. Затем измерьте пространственные изменения концентрации ионов кальция после механической стимуляции с помощью конфокального микроскопа, выполните сбор и сохранение изображений.

Наконец, с помощью программного обеспечения конфокального микроскопа выделите многоугольную область интереса, чтобы определить общую площадь поверхности реагирующих клеток. На репрезентативных псевдоцветных флуоресцентных изображениях показаны вызванные механической стимуляцией транзиенты кальция в эндотелиальных клетках роговицы быка в контрольных условиях; на первом изображении представлена интенсивность флуоресценции до стимуляции. Белая стрелка на втором изображении указывает на механически стимулированную клетку.

Кальциевая волна распространяется на шесть соседних клеточных слоев, при этом общая площадь клеток, охваченных волной, составляет 62 870 µm². Линейный график демонстрирует временной ход нормализованного значения флуоресценции (NF) в механически стимулированной клетке, обозначенной как ms, и среднее значение NF в соседних клеточных слоях с первого по пятый, обозначенных на графике как MB 1–MB 5. Эти изображения более детально показывают значительные изменения в распространении межклеточных кальциевых волн после обработки экзогенными нуклеотидами на графике слева и после обработки ингибиторами эктонуклеотидазы на графике справа. В частности, на графике слева наблюдается значительное уменьшение активной площади после обработки эндотелиальных клеток роговицы быка экзогенными апиразами Aase 6 и Aase 7, которые гидролизовали ATP и ADP, тем самым подавляя путь перикриновой межклеточной коммуникации.

Звездочка означает, что значение P составляет менее 0,001 при наличии ace по сравнению с его отсутствием. График справа демонстрирует значительное увеличение активной области после обработки BCEC селективным ингибитором эктонуклеотида A RL 6 7 1 56, что усиливает путь перикриновой межклеточной коммуникации. Звездочка означает, что значение P составляет менее 0,001 при наличии a RL по сравнению с его отсутствием. После освоения.

При правильном выполнении эта методика занимает от 5 до 10 минут для одного эксперимента в одном условии. Для проведения целой серии экспериментов, позволяющей сравнить различные условия и сделать статистические выводы, требуется один день. Необходимо использовать независимые эксперименты, проведенные в разные дни и с использованием разных партий изолированных клеток.

Измерение и количественная оценка распространения внутриклеточных кальциевых волн позволяют идентифицировать и охарактеризовать клеточно-биологическую регуляцию различных изоформ коннексинов, таких как щелевые каналы и полуканалы. Также следует отметить, что данный метод не является самодостаточным и должен дополняться другими молекулярными и функциональными подходами: от анализа переноса красителей до измерения выброса АТФ и электрофизиологии.