Биосенсоров для обнаружения устойчивых к антибиотикам бактерий Staphylococcus

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы различить устойчивые к метициллину или MRSA и чувствительные к метициллину штаммы золотистого стафилококка или MSSA с помощью специально отобранных антимодифицированных литических бактерий фагов. Когда бактерии прикрепляются к длинным гибким хвостам литического фага, расстояние между прикрепленными клетками и сенсорной поверхностью больше, чем проникновение акустической волны QC m. Поэтому сигнал о событии привязки не генерируется.

Замена интактного фага сфероидом приводит к получению полностью функционального фага с короткими хвостами, которые связывают бактерии в пределах глубины проникновения акустической волны QC m, тем самым способствуя изменениям частоты и диссипации, когда фаговые стероиды осаждаются на кристалле A-Q-C-M-D и подвергаются воздействию смешанной бактериальной суспензии, они связываются со штаммами MRSA и MSSA золотистого стафилококка. Но не другие бактерии, отделяющие золотистый стафилококк от других бактерий на поверхности кристалла. Наконец, при добавлении специфических гранул PPP-2 А, связанных с антителами Mr.RSA, генерируется сигнал в присутствии штаммов Mr.RSA золотистого стафилококка. Основные преимущества этой методики перед существующим методом, таким как ПЦР, заключаются в том, что этот метод не требует экстракции ДНК и не подвержен эмпирическим исследованиям.

Хотя этот метод может дать представление о скрининге и дезинфекции staphylococcus orus, он также может быть применен к другим устойчивым к антибиотикам бактериям. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку изготовление биосенсоров требует точности, аккуратности и терпения. Начните с очистки кусочков кварца с золотым кодом методом плазменного травления в Аргонне в течение 10 минут, а затем стерилизуйте кусочки в течение шести часов под ультрафиолетовым светом в стерильном шкафу после стерилизации в 50 микролитрах фаговой суспензии до золотой поверхности каждого изделия в стерильной чашке Петри, а затем инкубируйте кусочки в течение ночи во влажной камере при комнатной температуре на следующее утро. удалите остатки фаговой суспензии для тиревания, затем промойте каждый кусочек кварца связанным фагом пять раз с помощью PBS, чтобы удалить любой несвязанный фаг.

Чтобы проверить инфекционность иммобилизованного фага на сухой поверхности, сначала нанесите ночную культуру золотистого стафилококка на NZY eRate и дайте суспензии высохнуть. Затем положите на пластину кусочек кварца с золотым покрытием и обездвиженным фагом лицевой стороной вниз. Через 12 часов при 37 градусах Цельсия можно наблюдать зону лизиса, указывающую на инфекционность, чтобы проверить литическую активность свободного фага в жидкости.

Во-первых, добавьте ночную бактериальную культуру золотистого стафилококка в 10 миллилитров NZY в каждую из четырех 300-миллилитровых колб для пистолетов. Затем добавьте два раза по 10 к шести БОЕ на миллилитр свободного фага к двум колбам. Теперь отслеживайте временной ход лизиса клеток стафилококка в течение 570 минут путем измерения оптической плотности с интервалом в 30 минут для каждой колбы, проводя окончательное измерение через 24 часа.

Чтобы проверить литическую активность связанного фага в жидкости, повторите только что продемонстрированные шаги, но добавьте в экспериментальные колбы вместо свободного золотых кусочков со связанным фагом. Для приготовления фаговых стероидов сначала соедините 400 микролитров стоковой суспензии фага 1:2600 с равным объемом спектров фотометрического хлороформа в один миллилитровый флакон комнатной температуры. Затем осторожно переведите фаговую суспензию хлороформа пять-шесть раз с интервалом в пять секунд в течение одной минуты.

Дав суспензии стабилизироваться в течение 30 секунд, соберите верхнюю фракцию, содержащую стероидную суспензию. Перелейте несколько микролитров стероидной суспензии во флакон объемом 500 микролитров для проведения просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии. Сохраните оставшуюся стероидную суспензию в одном миллилитровом флаконе для изготовления биосенсора.

Чтобы подготовить биосенсор, сначала очистите датчики QCMD путем плазменного травления в аргоне в течение 10 минут в плазменном очистителе. Затем промойте датчики гексаном, чтобы удалить любые органические загрязнения. Затем очистите корыто от пленочного баланса, как ранее было описано Олсоном Эталом в Журнале микробиологических методов.

Наполнив желоб LB подфазным раствором и очистив его с помощью барьера для корыта. Затем стабилизируйте кормушку при температуре 20 градусов Цельсия в течение 10 минут. Теперь создайте фаговый монослой на субфазном растворе LB, осторожно капнув 300 микролитров Eloqua водной суспензии фага 1 2600 на наклонный съедобный стеклянный стержень, который частично погружен в фазу SOPH Дав монослою стабилизироваться в течение 10 минут, сжимайте монослой со скоростью 30 миллиметров в минуту до достижения постоянного давления 19 ньютонов на метр.

Вертикальное нанесение пленки является самой сложной частью этой процедуры. Чтобы обеспечить успех, необходимо убедиться в чистоте всех компонентов этой процедуры, а также оптимизировать параметры однослойного осаждения. Теперь опустите датчик внутрь и наружу монослоя семь раз подряд со скоростью 4,5 миллиметра в минуту, чтобы выполнить вертикальное осаждение пленки.

На перпендикулярно расположенный датчик QCMD. Вертикальное осаждение пленки связывает интактный фаг с поверхностью биосенсора. Наконец, используйте изготовленные фаговые биосенсоры для обнаружения MRSA, электронной микроскопии и эльоптометрии как свободного, так и связанного фага.

Начните этот шаг с определения базовых уровней, резонансной частоты и рассеивания энергии датчика QCM в воде с помощью программного обеспечения qof T. Примерно через 30 минут наберите через испытуемую клетку живые метициллин-чувствительные клетки золотистого стафилококка или бактерии MSSA в воде. Синяя линия показывает значение частоты, а красная линия — уровень рассеиваемой энергии.

Горизонтальные линии показывают установление базовой линии. Цифра два в центре экрана указывает на то, что события связаны с датчиком. Номер два из четырех непрерывно отслеживают изменения резонансной частоты и рассеивания энергии датчиков для первого показанного обертона.

Вот изменения после того, как бактерии проходят тестовую клетку. Обратите внимание, что требуется всего несколько секунд для уменьшения частоты и увеличения диссипации энергии, когда изменения резонансной частоты датчиков и внутренней диссипации энергии достигают уровней насыщения при скорости суспензии сопряженного латекса антител PVP с потоком и продолжается непрерывный мониторинг диссипации частоты. Здесь показан весь процесс обнаружения, показывающий установление базовых линий, изменение частоты и рассеивания энергии в несколько секунд после добавления бактерий, насыщение и, наконец, изменения после добавления гранул.

В этой таблице показана продемонстрированная фаговая литическая активность в отношении всех тестируемых штаммов S. reus, включая штаммы MRSA, согласно тесту фагового пятна. Размеры бляшек обычно варьировались от пяти до 15 миллиметров. Не было обнаружено активности по отношению к другим тестовым культурам.

Здесь продемонстрирован нормальный рост стафилококка Urus A TCC 1 2600 в среде NZ Y в шейкерном инкубаторе при 37 градусах Цельсия при увеличении количества бактерий от 3,2 до 10 до 6 до 4,0 умножить на 10 до восьми КОЕ на миллилитр. Примерно через 24 часа фаг, иммобилизованный на поверхности золота, продемонстрировал литическую активность, аналогичную активности фага в суспензии. Иммобилизованный фаг оставался заразным при свежей бактериальной инфекции даже после использования в 24-часовом эксперименте по выращиванию, нескольких промывок и хранения в PBS в течение шести дней при четырех градусах Цельсия.

На этом изображении можно наблюдать лизосому вокруг золотого изделия, указывающую на то, что иммобилизованные фаги способны лизировать бактериальные клетки. Таким образом, как показано здесь, эффективное снижение роста бактерий, обнаруженное при совместном культивировании бактерий и демобилизованного фага, является результатом первичного взаимодействия водно-взвешенных бактерий и связанного фага. Здесь показаны просвечивающие и сканирующие электронные микрофотографии интактного литического фага 12600 на поверхности золотой подложки, когда фаговая суспензия подвергается обработке хлороформом, хвост фага сокращается в длину и утолщается, а многоугольная головка становится округлой или стероидной.

Несмотря на значительные структурные изменения. Литическая активность стероида, измеряемая количеством бляшек, не изменялась в результате лечения хлороформом. Сенсоры ККМ с иммобилизованными литическими фагами не показали существенных изменений резонансной частоты или диссипации энергии при воздействии MRSA, что указывает на то, что фаговое взаимодействие MRSA привело к изменению номической массы.

Однако, по данным QCM, электронные микрофотографии биосенсоров после анализа показали значительное связывание бактерий на поверхности сенсора. При введении суспензий MRSA в проточную ячейку с помощью фаговых стероидных биосенсоров наблюдалось существенное снижение частоты и увеличение диссипации. После связывания бактерий MRSA фагов sphero датчики анализа подвергались воздействию конъюгированных латексных суспензий скоростей антител BBP 2 A.

Эти биосенсоры анализа MRSA реагировали на конъюгированные латексные суспензии двух антител А BPP, поскольку наблюдалось дальнейшее снижение частоты и увеличение диссипации. Связывание MSA с фаговыми зондами и конъюгированными латексными скоростями антитела PPP-2 A было подтверждено с помощью сканирующей электронной микроскопии. Когда фаговый стероидный биосенсор подвергался воздействию MSSA, наблюдалось существенное снижение частоты и увеличение диссипации после связывания фагового стероида MSSA, анализирующие сенсоры подвергались воздействию латексных скоростных суспензий, конъюгированных с антителами PPP 2 A.

Первоначально биосенсор с помощью анализа MSSA показал короткую преходящую величину увеличения частоты и снижение диссипации после нескольких минут взаимодействия MSSA и конъюгированного латексного антитела PPP двух А. Тем не менее, частота возвращается к двум уровням введения антител А после PVP, но энергия деци увеличивается. Связывание MSSA с фаговыми зондами было затем проанализировано с помощью сканирующей электронной микроскопии, но здесь не наблюдалось связывания между MSSA и скоростями, сопряженными с двумя антителами PPP, показано, показан симметричный профиль толщины эллипсов и 3D-карта толщины литического фага.

Для создания профиля толщины на карте толщины была проведена линия. На этих последних изображениях представлены репрезентативные изображения MRSA с помощью ПЗС-оптической камеры, полученные фагами, связанными с золотой поверхностью датчика A-Q-C-M-D, и 3D-профили интенсивности MRSA на подложках из иммобилизованного стекла фагов в концентрации от 10 до восьми КОЕ на миллилитр и от 10 до девяти КОЕ на миллилитр. Каждый круглый круг представляет собой одну бактерию.

Очевидно, что увеличение концентрации бактерий в жидкой суспензии с 10 до 8 КОЕ на миллилитр до 10 до 9 КОЕ на миллилитр приводит к значительному увеличению захваченных бактерий в 3D-профилях интенсивности. Количество белых пиков на верхнем слое пропорционально количеству захваченных бактерий, и, как и ожидалось, плотность пиков значительно увеличивается при увеличении бактериального воздействия с 10 до восьми до 10 до девяти КОЕ на миллилитр. Нижний темно-синий слой соответствует фаговому слою, контактирующему с золотой подложкой.

По мере того, как захватывается больше бактерий, оптические свойства фагов изменяются, поскольку они связывают бактерии, что приводит к более темному и интенсивному синему цвету. Следуя этой процедуре, мы можем определить эффективность захвата бактерий, чтобы понять взаимодействие фаговых бактерий после развития. Этот метод показывает путь для исследователей в области бактериальной фаготерапии для изучения ингибирования патогенов у животных и человека Не забывайте, что работа с органическими растворителями в патогенных бактериях может быть чрезвычайно опасной, и соблюдение строгого регулирования очень важно.