Измерение механических свойств живых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии

Общая цель данного эксперимента — измерить модуль упругости живых клеток с помощью атомно-силового микроскопа. Это достигается путем выполнения измерений с помощью силовой спектроскопии FM в различных местах на элементе. В качестве второго шага анализируется каждая кривая вынужденного расстояния, чтобы определить точку, где наконечник A FM первоначально вступает в контакт с клеткой.

Затем, начиная с точки контакта, первые 200–300 нанометров данных вдавливания подгоняются к модели Hertz. Для того, чтобы извлечь модуль упругости, результаты дают 2D-карту жесткости ячейки, полученную с помощью режима отображения силы, где каждый пиксель представляет собой одну вынужденную кривую расстояния. Продемонстрируя эту процедуру, будет Гуэн Томас, аспирант из моей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, очистите держатель консоли с 70% этанолом и дайте ему высохнуть.

Затем загрузите консоль bru DNP 10 в A FM в соответствии с инструкциями производителя. Далее откалибруйте обратную чувствительность оптического рычага. Этот параметр описывает величину отклика фотодиода в вольтах на нанометр прогиба кантилевера.

Для этого сначала загрузите на предметный столик чистое предметное стекло. Установите FM-головку и отрегулируйте лазерный луч и юстировку в соответствии с инструкциями производителя. После выравнивания зацепите наконечник A FM на предметном стекле с вынутым P 8 O.

Выровняйте зеркало по показаниям фотодиода отрицательных двух вольт. Затем выполните измерение силовой спектроскопии с максимальным откликом фотодиода или точкой срабатывания положительных двух вольт. После завершения сбора данных увеличьте масштаб в области жесткого контакта кривой силы и выполните линейную подгонку к этой области.

Чтобы найти наклон в вольтах на нанометр, затем сбросьте юстировку зеркала в положение свободного отклонения в ноль вольт. Затем откалибруйте постоянную консольной пружины с помощью метода термонастройки, описанного Леви и Маламом. Для начала поднимите сканер в сторону от стадии образца, чтобы не было никаких взаимодействий между наконечником и образцом.

Затем зарегистрируйте тепловые данные, записав тепловую вибрацию консольного луча. Программное обеспечение A FM анализирует спектр мощности такой тепловой вибрации и отображает его в окне данных. Затем выполните подгонку к сегменту данных, центрированному на самой низкой частоте, также известной как пик фундаментального резонанса, для определения постоянной пружины.

Чтобы подготовить FM для тарелок для культивирования, установите на FM-сцену аксессуар для нагрева посуды и установите температуру на 37 градусов Цельсия. Подождите 20 минут, пока система не достигнет устойчивого теплового равновесия. После предварительного нагрева поместите чашку для культуры на столик FM и закрепите ее с помощью зажима, прилагаемого к нагревателю чашки, для измерений продолжительностью более 30 минут, для замены обычной питательной среды следует использовать независимую от углекислого газа среду.

Затем нанесите небольшую каплю питательной среды 37 градусов Цельсия на кончик кантилевера A FM и опустите головку A FM до тех пор, пока кончик не погрузится в жидкость. С помощью ПЗС-матрицы с видом сверху перенастройте лазерный луч на консоль. Выравнивание в жидкости будет отличаться от выравнивания в воздухе из-за изменения показателя преломления среды.

После выравнивания зафиксируйте наконечник A FM на бесклеточной области чашки для культур и выполните калибровку обратной чувствительности оптического рычага в жидкой среде. Чтобы начать измерение механических свойств клеток, расположите кончик кантилевера над областью глаза клетки с помощью оптического микроскопа. Точная регулировка положения консолей осуществляется путем нанесения смещений на сканеры X и Y.

Затем переключите FM в режим четырех спектроскопии и установите скорость вдавливания на уровне пяти микрометров в секунду, что достаточно низко, чтобы избежать гидродинамических эффектов. Затем установите триггерную точку отклонения на два наноньютона. Во избежание повреждения ячеек отрегулируйте это значение в соответствии с жесткостью образца.

Кроме того, выберите опцию относительного срабатывания, которая будет корректировать любой дрейф сигнала отклонения. Затем установите расстояние усилия на уровне пяти микрометров, чтобы убедиться, что наконечник будет полностью отделен от ячейки между измерениями силы. Соберите три силовые кривые в разных местах в области ядер не менее 30 клеток для каждого условия.

Хотя выгодно брать несколько кривых на каждой ячейке. Для получения достоверных статистических данных слишком большое количество может привести к изменению жесткости клеток до дистресса от зонда A FM. Дополнительно охарактеризуйте распределение механических свойств по одному элементу с помощью режима карты сил.

В режиме карты сил установите размер сканирования на 30 микрометров, разрешение на 32 на 32, а параметры отступа будут такими же, как и для одиночных кривых силы. Затем A FM возьмет отдельные силовые кривые в каждом пикселе в области выборки и предоставит карту жесткости всей области. Затем проанализируйте записанные кривые силы с помощью MATLAB для расчета жесткости ячейки.

Начните с использования алгоритма, впервые опубликованного Линетт Эл, который вычисляет как линейную аппроксимацию, так и аппроксимацию герца от каждой точки с помощью matlab. Вычислите относительную среднеквадратичную ошибку обоих аппроксимаций и просуммируйте эти значения в каждой точке. В качестве начальной точки контакта выбирается точка, которая достигает минимальной общей погрешности подгонки, расположение которой имеет решающее значение для точного измерения модуля модуля юнга клеток.

Далее рассчитайте дельту деформации образца. Используя следующие уравнения, деформация равна нулю до контакта с ячейкой, где Z меньше нуля Z и равна разности между прогибом кантилевера D и общим расстоянием Z после точки контакта. Затем рассчитайте вдавливающую силу F с помощью следующих уравнений, где сила равна нулю до контакта с ячейкой, где Z меньше нуля Z и равна постоянной пружины K кантилевера, умноженной на прогиб кантилевера мимо точки контакта.

Затем аппроксимация квадрата Элизы применяется к данным о деформации образца в зависимости от силы вдавливания в области после контакта модели герца, чтобы извлечь модуль Юнга ячейки на основе формы используемого наконечника, показанной на рисунке. Ниже приведены репрезентативные силовые кривые, взятые из трех Т-трех фибробластных клеток, культивируемых на трех различных поверхностях. Как вы можете видеть здесь, различные поверхности могут сильно влиять на жесткость цитоскелета клетки.

Средняя деформация клеток, культивируемых на твердой пластиковой поверхности, показана красным цветом. Те, которые выращены на жестком полиакриламидном геле, показаны фиолетовым цветом, а те, которые выращены на эластичном полиакриламидном геле, показаны синим. После тщательного определения точек контакта на кривых можно точно показать силы вдавливания в зависимости от деформации ячейки.

Кроме того, их модульный Young's можно точно рассчитать по первым 300 нанометрам вдавливания после контакта. Здесь показан фибробласт, который был трансфицирован зеленым флуоресцентным белком, помеченным ментоном, типом промежуточного филамента. Чем ярче изображение, тем больше ментона в этой области.

Это может быть связано с жесткостью цитоскелета клетки. Используя представленный здесь метод отображения сил A FM, можно отобразить аналогичную карту жесткости фибрбласта с разрешением 32 на 32 пикселя, где каждый пиксель представляет площадь поверхности клетки размером 2,5 на 2,5 микрона. После просмотра этого видео у него будет хорошее представление о том, как использовать атомно-силовую микроскопию для измерения эластичности живых клеток тканей.