Измерение механических свойств живых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии

Общая цель следующего эксперимента — измерить модуль упругости живых клеток с помощью атомно-силового микроскопа. Для этого сначала проводится измерение методом частотно-модулированной (FM) силовой спектроскопии в различных точках клетки. На втором этапе каждая кривая зависимости силы от расстояния анализируется для определения точки, в которой зонд АСМ впервые вступает в контакт с клеткой.

Далее, начиная с точки контакта, первые 200–300 нанометров данных индентации аппроксимируются по модели Герца. Для определения модуля упругости результаты представляются в виде 2D-карты жесткости клетки, полученной с помощью режима картирования сил, где каждый пиксель соответствует отдельной кривой зависимости силы от расстояния. Процедуру продемонстрирует Гюэн Томас, аспирант моей лаборатории. Для начала процедуры очистите держатель кантилевера 70% этанолом и дайте ему высохнуть.

Затем установите кантилевер bru DNP 10 в АСМ в соответствии с инструкциями производителя. После этого откалибруйте чувствительность обратного оптического рычага. Этот параметр определяет величину отклика фотодиода в вольтах на нанометр отклонения кантилевера.

Для этого сначала поместите чистый предметное стекло на предметный столик. Установите головку АСМ, отрегулируйте лазерный луч и юстировку в соответствии с инструкциями производителя. После выполнения юстировки подведите зонд АСМ к предметному стеклу, удерживая P eight O в оттянутом положении.

Перенастройте зеркало так, чтобы показания фотодиода составляли -2 В. Затем проведите измерение методом силовой спектроскопии с максимальным откликом фотодиода или точкой срабатывания триггера +2 В. После завершения сбора данных увеличьте область плотного контакта на кривой силы и проведите линейную аппроксимацию этой области.

Чтобы определить наклон в вольтах на нанометр, сбросьте юстировку зеркала до значения свободного отклонения в 0 вольт. Затем откалибруйте константу жесткости кантилевера методом термической настройки, описанным Леви и Маламом. Для начала поднимите сканер над столиком с образцом, чтобы исключить взаимодействие между зондом и образцом.

Затем зафиксируйте тепловые данные, записав тепловые колебания консольной балки. Программное обеспечение А FM анализирует спектр мощности таких тепловых колебаний и отображает его в окне данных. Далее выполните аппроксимацию сегмента данных, центрированного на самой низкой частоте, также известной как основной резонансный пик, для определения константы жесткости.

Для подготовки системы a FM к работе с культуральными планшетами установите аксессуар — нагреватель планшета на платформу a FM и установите температуру 37 °C. Подождите 20 минут до достижения системой стабильного теплового равновесия. После предварительного нагрева поместите культуральный планшет на платформу a FM и зафиксируйте его с помощью зажима, входящего в комплект нагревателя планшета; для измерений продолжительностью более 30 минут следует использовать среду, не зависящую от содержания углекислого газа, вместо обычной культуральной среды.

Затем нанесите небольшую каплю культуральной среды с температурой 37 °C на кончик кантилевера АСМ и опустите головку АСМ до тех пор, пока кончик не будет погружен в жидкость. С помощью CCD-камеры с видом сверху заново юстируйте лазерный луч на кантилевере. Юстировка в жидкости будет отличаться от юстировки на воздухе из-за изменения показателя преломления среды.

После выравнивания установите зонд А FM на свободный от клеток участок чашки с культурой и выполните калибровку чувствительности обратного оптического рычага в жидкой среде. Чтобы начать измерение механических свойств клеток, с помощью оптического микроскопа расположите кончик кантилевера над областью перикулярного глаза клетки. Точная регулировка положения кантилевера осуществляется путем применения смещений по сканерам X и Y.

Затем переключите АСМ в режим спектроскопии и установите скорость индентирования на 5 µm/s, что достаточно мало для предотвращения гидродинамических эффектов. Далее установите точку срабатывания триггера отклонения на 2 nN. Чтобы избежать повреждения клеток, отрегулируйте это значение в соответствии с жесткостью образца.

Кроме того, выберите опцию относительного срабатывания (relative triggering), чтобы скомпенсировать любой дрейф сигнала отклонения. Затем установите расстояние по силе на 5 µm, чтобы обеспечить полное отсоединение зонда от клетки между измерениями силы. Снимите три кривые силы в разных точках области ядер как минимум для 30 клеток для каждого условия.

Хотя снятие нескольких кривых для каждой клетки является полезным, для получения надежных статистических данных следует избегать избыточного количества измерений, так как это может привести к изменению жесткости клеток из-за воздействия зонда АFM. Для дальнейшей характеристики распределения механических свойств в пределах одной клетки используйте режим картирования сил.

В режиме картирования сил установите размер сканирования 30 микрометров, разрешение 32 на 32, а параметры индентирования оставьте такими же, как при записи одиночных кривых силы. После этого А FM снимет одиночные кривые силы в каждом пикселе области образца и построит карту жесткости всего региона. Затем проанализируйте записанные кривые силы с помощью MATLAB для расчета жесткости клеток.

Начните с применения алгоритма, впервые опубликованного Линетт Аль, который с помощью MATLAB вычисляет как линейную аппроксимацию, так и аппроксимацию по Герцу для каждой точки. Рассчитайте относительную среднеквадратическую ошибку (RMS) для обеих аппроксимаций и суммируйте эти значения в каждой точке. Точка, в которой достигается минимальная суммарная ошибка аппроксимации, выбирается в качестве начальной точки контакта; определение этой точки имеет решающее значение для точного измерения модуля Юнга клеток.

Затем рассчитайте величину деформации образца delta. Используйте следующие уравнения, при которых деформация равна нулю до контакта с клеткой, когда Z меньше Z zero, и равна разности между прогибом кантилевера D и общим расстоянием Z после точки контакта. Затем рассчитайте силу вдавливания F с помощью следующих уравнений, при которых сила равна нулю до контакта с клеткой, когда Z меньше Z zero, и равна произведению константы жесткости K кантилевера на величину прогиба кантилевера после точки контакта.

Затем аппроксимация по методу Элиза-сквер применяется к данным зависимости деформации образца от силы вдавливания в области после контакта модели Герца, чтобы определить модуль Юнга клетки на основе формы используемого наконечника, представленного на рисунке. Здесь приведены репрезентативные кривые силы, полученные от трех клеток фибробластов T3, культивируемых на трех различных поверхностях. Как видно здесь, различные поверхности могут существенно влиять на жесткость цитоскелета клетки.

Средняя деформация клеток, культивируемых на твердой пластиковой поверхности, показана красным цветом. Клетки, выращенные на жестком полиакриламидном геле, показаны пурпурным цветом, а клетки, выращенные на эластичном полиакриламидном геле, — синим цветом. После тщательного определения точек контакта на кривых можно точно отобразить силу вдавливания в зависимости от деформации клеток.

Кроме того, их модуль Юнга можно точно рассчитать по первым 300 нанометрам индентации после контакта. Здесь показан фибробласт, трансфецированный ментоном — типом промежуточных филаментов, помеченным зеленым флуоресцентным белком. Чем ярче изображение, тем больше ментона находится в данной области.

Это может быть связано с жесткостью цитоскелета клетки. Используя представленный здесь метод картирования сил АСМ, можно получить аналогичную карту жесткости фибробласта с разрешением 32 на 32 пикселя, где каждый пиксель соответствует площади поверхности клетки 2,5 на 2,5 микрон. После просмотра данного видео у вас сформируется четкое представление о том, как использовать атомно-силовую микроскопию для измерения эластичности живых клеток ткани.