Визуализация черепно-лицевого развития в Sox10: Kaede Трансгенные данио рерио Линия Использование Покадровый конфокальной микроскопии
30 сентября 2013 г.
Визуализация экспериментальных данных стала ключевым элементом в представлении результатов для научного сообщества. Генерация живой покадровой записи растущих эмбрионов способствует лучшей презентации и понимания сложных процессов развития. Этот протокол является шаг за шагом руководство по маркировке элементов через фотопреобразования Kaede белка у рыбок данио.
Общая цель следующего эксперимента заключается в получении записи таймлапс-видео миграции клеток нервного гребня в реальном времени для демонстрации формирования развивающихся структур черепно-лицевого отдела. Для этого сначала анестезированную трансгенную рыбу zebrafish SOX 10 KD монтируют в агарозе, чтобы минимизировать ее движение на протяжении всего эксперимента. Затем с помощью конфокального микроскопа проводят УФ-фотоактивацию для переключения KD с зеленого на красный цвет в клетках нервного гребня.
Затем внимание переключается на фотоконвертированные клетки нервного гребня. Перед записью таймлапс-видео создается Z-стек развивающейся структуры. Полученные результаты демонстрируют развитие краниальных клеток нервного гребня в первичный нёбный отросток данио-рерио в трансгенном эмбрионе zebrafish SOX 10 KD.
Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как статическая визуализация, является возможность наблюдения за сложными процессами развития, например миграцией клеток, в режиме реального времени. Это делает результаты более доступными для научного сообщества. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов биологии развития, таких как механизмы формирования структур, производных от клеток нервного гребня, и влияние генов PTO на их развитие.
Для подготовки к монтированию эмбрионов используйте колбу объемом 125 мл, чтобы смешать воду E3 с низкоплавким агарозой, и растворите смесь в микроволновой печи. Затем добавьте TRICA и поместите колбу в водяную баню при 50 °C для поддержания температуры; отберите ярко флуоресцирующих трансгенных zebrafish эмбрионов со сниженной экспрессией soine KD на 60-м часу после оплодотворения. Затем перенесите каждый эмбрион на предметное стекло с камерой, используя салфетку для тканей.
Удалите избыток раствора E3, затем залейте эмбрион раствором агарро. С помощью наконечника микродозатора расположите эмбрион строго дорсально, чтобы он был полностью погружен в агарро. После застывания агарро заполните камерную slide раствором E3 с 0,015% tricaine для проведения фотоконверсии.
Для начала используйте объектив с воздушным погружением 20x для фокусировки на эмбрионе. Затем нажмите кнопку освещения L 100 на микроскопе и выберите соответствующие каналы в программном обеспечении. Откройте иконки.
Перейдите в настройки элементов управления сбора данных A one и нажмите кнопку настройки конфокального микроскопа. Затем нажмите auto и выберите DPI 4 88 и 561.9 для каналов 1, 2 и 3 соответственно, после чего снова закройте окно. Затем выключите первый и третий каналы, нажмите кнопку снятия блокировки (remove interlock) и нажмите кнопку сканирования (scan), установив скорость один кадр в секунду и HV 200.
Начните фокусировку на интересующих клетках. Постепенно увеличивайте частоту кадров до одного кадра за 32 и снижайте напряжение до 100–120 в зависимости от уровня фонового шума. Когда эмбрион окажется в фокусе, захватите зеленую рамку у правого края экрана и уменьшите ее так, чтобы она охватывала область, предназначенную для фотоконверсии, после чего щелкните правой кнопкой мыши.
Установите частоту кадров на 1, высокое напряжение (HV) на 200 и нажмите кнопку сканирования (scan). Теперь станет видно увеличенное изображение области фотоконверсии. Следующая фотография.
Проведите конверсию клеток, включив первый канал на время от 5 до 60 с, пока зеленый сигнал KD почти полностью не исчезнет. Затем выключите этот канал. Включите второй и третий каналы, чтобы вернуться к исходному увеличению.
Щелкните правой кнопкой мыши по окну масштабирования и выберите «вернуть исходный размер», чтобы проверить, достаточно ли качественно была выполнена фотоконверсия нужных клеток. Установите границы Z-стека, выбрав значок Capture Z Series на панели меню. Настройте таблицы поиска (LUT), чтобы подготовить таймлапс-съемку.
Выберите простой графический интерфейс A и установите следующие параметры: частота кадров 32 кадра в секунду, размер 1024 и усреднение 4 или 8 x в зависимости от количества Z-стеков, которые необходимо получить за один цикл.
Затем перейдите в раздел управления сбором данных «ND sequence acquisition» и установите временной интервал. После этого нажмите «continuous», а затем «Zack». Установите границы, как было продемонстрировано ранее.
Запустите видео, добавьте в камеру раствор E three 0.015%trica, аккуратно переместите его и полностью заполните камеру для проведения визуализации в течение ночи. После завершения визуализации создайте высококачественное видео из файла визуализации, нажав кнопку «show maximum intensity projection». Затем щелкните правой кнопкой мыши по изображению и выберите «create new document».
Удалите ненужные кадры и настройте уровни яркости (Luts). В данном видеоролике, демонстрирующем палатогенез у данио-рерио, используется трансгенная линия SOX 10 K для отслеживания клеток краниального нервного гребня в процессе их развития при формировании первичного неба. Наиболее передние клетки формирующегося неба подвергаются фотоконверсии из зеленого в красный цвет через 60 часов после оплодотворения.
Когда парные трабекулы соединяются, образуя первичный нёбный отросток, за перемещением этих клеток следят до тех пор, пока они не достигнут своего конечного пункта назначения. В данном видео продемонстрировано нарушение развития нёба, приводящее к образованию орофациальной расщелины, при нокдауне гена speck, опосредованном morino. В качестве примера используется ген One lb, участвующий в формировании косых расщелин лица.
Через 60 HPF односторонняя фотоконверсия клеток самой передней части решетчатой пластинки демонстрирует нарушение слияния между клетками медиальной и латеральной решетчатых пластинок. Этот дефект напоминает патогенез развития косых расщелин лица у людей, при которых происходит нарушение слияния между латеральным носовым отростком и верхнечелюстным выступом. Данный метод открыл исследователям в области биологии развития путь к изучению развития клеток нервного гребня у zebrafish.
После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как использовать данный метод для регистрации интересующего вас процесса развития.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод визуализации миграции клеток нервного гребня в эмбрионах zebrafish с помощью записи живых изображений в режиме таймлапса. Используя фотоконверсию белка kaede, исследователи могут более детально изучить развитие структур черепа и лица.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Эмбриология
Теоретические основы
- Визуализация экспериментальных данных имеет решающее значение для научной коммуникации.
- Записи в режиме таймлапс расширяют понимание сложных процессов развития.
- Трансгенные модели данио-рерио (zebrafish) представляют большую ценность для изучения динамики клеток нервного гребня.
- Методы фотоконверсии позволяют осуществлять точный трекинг клеточных изменений.
Цель исследования
- Для получения записей в режиме реального времени (time-lapse) миграции клеток нервного гребня.
- Для иллюстрации процесса формирования структур черепно-лицевого отдела у zebrafish.
- Для использования фотоконверсии с целью улучшения визуализации клеточных процессов.
Используемые методы
- Фиксация анестезированных трансгенных личинок зебралезачкa (zebrafish) с нокаутом SOX 10 в агарозе.
- Проведение УФ-фотоактивации для перевода белка kaede из зеленого спектра в красный.
- Фокусировка на фотоконвертированных клетках нервного гребня с помощью конфокального микроскопа.
- Запись таймлапс-видео для фиксации развития краниальных структур.
Основные результаты
- Успешная визуализация миграции клеток нервного гребня у zebrafish.
- Демонстрация развития клеток черепного нервного гребня в первичный нёбный свод.
- Создание видео с функцией таймлапс, демонстрирующего клеточную динамику.
- Изучение роли SOX 10 в развитии краниофациальных структур.
Выводы
- Данный протокол эффективно демонстрирует поведение клеток нервного гребня in vivo.
- Фотоконверсия является мощным инструментом для изучения процессов развития.
- Полученные результаты способствуют пониманию развития краниофациальных структур.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Визуализация динамики клеток краниального нервного гребня у зебрафиша позволяет создать прогностическую модель для механистического снижения рисков при валидации мишеней краниофациального развития. Трансгенная система sox10:kaede обеспечивает высокоразрешающий временной трекинг процессов миграции и дифференцировки, имеющих значение для морфогенеза лица человека. Данный подход способствует раннему поиску новых терапевтических мишеней, связывая генетические нарушения с фенотипическими исходами в системе, релевантной для изучения заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Раннее обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем отслеживания вклада черепного нейрального гребня в формирование элементов верхней и нижней челюстей.
- Практическая ценность: Обеспечивает точное ограничение линий развития с помощью фотоконвертируемого репортера kaede, что снижает неоднозначность маркировки по сравнению с инъекциями красителя.
- Прогностическая ценность: Служит базой для фенотипического скрининга краниофациальных мутантов с целью оценки воздействия на мишени и модуляции сигнальных путей.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные пространственно-временные данные о миграции клеток и конвергенции тканей для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимые результаты таймлапс-съемки, совместимые с конвейерами высокопроизводительного анализа изображений.
- Масштабируемость: может быть адаптирована для любого репортера kaede или другого фотоконвертируемого репортера у трансгенных zebrafish для повторного использования платформы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: иллюстрирует гомологию лицевых выступов zebrafish амниотам, повышая трансляционную значимость.
- Практическая ценность: позволяет фиксировать как нормальное, так и аномальное развитие черепно-лицевых структур у мутантов для фенотипической валидации.
- Снижение рисков: обеспечивает возможность наблюдения за дефектами экссудации, моделирующими патогенез расщелин ротоглотки у человека.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска новых соединений, обеспечивая прижизненную визуализацию структур, производных от нервного гребня, перед проведением скрининга соединений.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о функции генов в миграции черепного нейроэктодермального гребня и формировании нёба.
- Скрининг: предоставляет количественные данные конфокального анализа для оценки влияния соединений на динамику клеток.
- Аналитика: позволяет измерять скорость миграции, время конвергенции и формирование границ тканей.
- Трансляционные исследования: связывает развитие нёба у zebrafish с гомологами лицевого скелета человека для согласования биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного использования методов визуализации для оценки фенотипов развития в различных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней за счет прямой визуализации процессов принятия решений о судьбе клеток.
- Операционная ценность: Стандартизирует протоколы фотоактивации и тайм-лапс микроскопии для воспроизводимого отслеживания нейрального гребня.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем установления связи между генетическими мишенями и наблюдаемыми краниофациальными фенотипами.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе степени выраженности фенотипа развития.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы в области эмбриологии zebrafish, конфокальной микроскопии и работы с фотоконвертируемыми белками.
- Метод зависит от наличия конфокальных систем с возможностью УФ-возбуждения и инфраструктуры для иммобилизации эмбрионов путем вложения в агарозу.
- Необходима стандартизация продолжительности фотоактивации и параметров получения z-стека для всех пользователей.
- При адаптации метода следует учитывать использование различных репортеров под разными промоторами и стадии развития различных линий zebrafish.
- Практические ограничения включают фототоксичность при длительном УФ-облучении и влияние на жизнеспособность эмбрионов во время продолжительной визуализации.
