Визуализация черепно-лицевого развития в Sox10: Kaede Трансгенные данио рерио Линия Использование Покадровый конфокальной микроскопии

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы в реальном времени получить запись миграции клеток нервного гребня, чтобы показать формирование развивающихся черепно-лицевых структур. Это достигается путем установки анестезирующего трансгенного данио-рерио SOX 10 KD в агарозу, чтобы свести к минимуму движения на протяжении всего эксперимента. Далее под конфокальным микроскопом проводится УФ-фотоактивация для преобразования KD из зеленого в красный в клетках нервного гребня.

Затем, ориентируясь на фотографию, преобразуются клетки нервного гребня. Зак генерируется из развивающейся структуры перед записью покадрового видео. Получены результаты, которые показывают развитие клеток черепного нервного гребня в первичное небо данио-рерио у трансгенного эмбриона данио-рерио SOX 10 KD.

Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как статическая визуализация, заключается в том, что сложные процессы развития, такие как миграция клеток, могут быть визуализированы в режиме реального времени. Это делает результаты более доступными для научного сообщества. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии развития, например, как формируются структуры, производные от клеток нейрогребня, и как гены PTO влияют на их развитие.

Чтобы подготовиться к монтированию эмбрионов, с помощью колбы объемом 125 миллилитров смешайте Е три воды с низкой температурой плавления аэроса в микроволновой печи, чтобы раствор растворился. Затем добавьте трику и поместите колбу на водяную баню при температуре 50 градусов Цельсия, чтобы сохранить тепло и гнездить завязки ярко флуоресцентного трансгенного соина KD рыб зебры через 60 часов после оплодотворения. Затем переложите их каждый на предметное стекло с папиросной бумагой.

Впитайте в себя излишки Е трех вод, а затем используйте раствор агарро, чтобы покрыть зародыш. Используйте наконечник микрозагрузчика, чтобы расположить эмбрион идеально дорсально, гарантируя, что эмбрионы полностью погружены в агарро. После того, как агарро схватится, используйте E three 0,015%trica для заполнения предметного стекла камеры для проведения фотоконвертации.

Начните с использования объектива с 20-кратным воздушным погружением для фокусировки на эмбрионе. Затем нажмите кнопку L 100 light на микроскопе и выберите каналы в программном обеспечении. Откройте иконки.

Просмотр элементов управления захватом данных A one settings и нажмите кнопку настройки конфокального фокуса. Далее нажмите auto и выберите DPI 4 88 и 561.9 для каналов 1, 2, 3 соответственно, прежде чем снова закрыть окно. Затем выключите первый и третий каналы, прежде чем нажать кнопку удаления блокировки и нажать кнопку сканирования, начиная с одного кадра в секунду и HV 200.

Начните сосредотачиваться на интересующих вас клетках. Постепенно увеличивая количество кадров в секунду до одного в 32, и снижая напряжение до 100-120 в зависимости от фонового шума. Когда эмбрион окажется в фокусе, возьмитесь за зеленый ободок у правого края экрана и уменьшите его по размеру области, которую нужно преобразовать, прежде чем щелкать правой кнопкой мыши.

Измените количество кадров в секунду на один, а HV на 200 и нажмите кнопку сканирования. Теперь будет видно увеличенное изображение области преобразования фотографий. Следующее фото.

Преобразуйте ячейки, включив первый канал на срок от пяти до 60 секунд, пока зеленый сигнал KD практически не исчезнет. Затем выключите канал dappy. Включите второй и третий каналы, чтобы вернуться к исходному зуму.

Щелкните правой кнопкой мыши по окну масштабирования и выберите «Вернуться к исходному размеру», чтобы проверить, правильно ли преобразованы фотографии нужных ячеек. Установите ограничения Zack, выбрав значок Capture Z Series в строке меню. Настройте таблицы подстановки или uts, чтобы настроить интервальную съемку.

Выберите поле A one simple GUI и отметьте следующие настройки. Один раз в 32 кадра в секунду. Размер 1024 и в среднем четыре или восемь x в зависимости от количества Z стеков, которые должны быть взяты в одном цикле.

Далее перейдите к просмотру элементов управления захватом ND последовательности сбора данных и установите временные рамки. Затем нажмите «Непрерывный», а затем «Зак». Установите границы, как показано ранее.

Запустите фильм, добавьте в камеру раствор E three 0,015% трика, скользите в течение дня и полностью заполните камеру для ночной визуализации. Когда визуализация будет завершена, создайте видео высокого качества из файла изображения, нажав кнопку «Показать проекцию максимальной интенсивности». Затем щелкните правой кнопкой мыши по изображению и создайте новый документ.

Удалите ненужные кадры и отрегулируйте Luts. В этом фильме, показывающем Palato Genesis у рыбок данио, трансгенная линия SOX 10 K используется для отслеживания клеток черепного нервного гребня по мере их развития, формируя первичное нёбо. Самые передние клетки формирующегося нёба преобразуются из зеленого в красный через 60 часов после оплодотворения.

Когда парные трабекулы встречаются, образуя первичное нёбо, за этими клетками следуют до тех пор, пока они не достигнут своего конечного пункта назначения. На этом снимке демонстрируется нарушение развития нёба, приводящее к образованию орофациальной щели, опосредованной морино нокдауном пятнышка. В качестве примера используется ген, участвующий в косой лицевой расщелине.

При 60 HPF односторонняя фотоконверсия наиболее передних клеток решетчатой пластинки показывает неудачный выпот между срединными и латеральными клетками решетчатой пластины. Этот дефект напоминает патогенез развития косой лицевой щели у человека, где происходит неудачный выпот между боковым носовым отростком и верхнечелюстным выступом. Этот метод проложил путь исследователям в области биологии развития к изучению развития клеток нейрогребня у рыбок данио.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать этот метод, чтобы запечатлеть интересующий вас процесс развития.