Многомасштабных Модификация металлических имплантатов с поры градиенты, полиэлектролитов и их косвенного мониторинга В естественных условиях

Общая цель этой процедуры заключается в модификации металлических имплантатов в нескольких масштабах длины для контроля поведения клеток in vitro и in vivo. Это достигается путем создания градиента размера пор в трехмерных трубчатых имплантатах методом экстракции Biofreeze. Вторым шагом является разработка нанофибриллярных имитаторов базальной мембраны на основе коллагена и альгината по послойной методологии.

Далее следует непрямой метод контроля таких имплантатов после имплантации с помощью анализа плазмы крови. ВЭЖХ и последующее пептидное секвенирование в конечном итоге демонстрируются на имплантате, где в разных областях могут размещаться различные типы клеток по мере необходимости. Для некоторых многоклеточных тканей можно получить Хотя эта система может обеспечить способ модификации металлических имплантатов.

Он также может быть применен к системам 3D-моделирования клеточных культур, таким как искусственные ткани или модели заболеваний. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы пытались найти метод контроля движения клеток вокруг пористых титановых имплантатов in vivo. Чтобы начать эту процедуру, очистите имплантаты, а также спроектируйте и изготовьте тефлоновые формы, как описано в письменном тексте, для замораживания и извлечения.

Приготовьте раствор синтетического полимера PLLA в бинарной смеси диоксина и воды, введя полимерный порошок в органический растворитель. На магнитном Старре нагрейте смесь до 60 градусов Цельсия с целью получения однородного раствора. Эта температура выбрана потому, что она является более высоким пределом температурной стойкости для прецизионных стеклянных шприцев, которые будут использоваться для введения раствора в имплантаты.

Тем временем рассчитайте объем необходимого полимерного раствора с учетом пористости имплантата с учетом изменения объема замороженного раствора. Далее вводят раствор в имплантаты с помощью прецизионных стеклянных шприцев с точностью до 0,1 микролитра. Нижний предел концентрации полимера составляет 3% для воспроизводимого формирования градиента PO, или, поскольку становится трудно получить однородное распределение в толстых образцах выше 6%, заморозьте образцы либо непосредственно при минус 80 градусах Цельсия, либо с предварительным инкубационным периодом 30 минут при комнатной температуре.

Условия замерзания частично определяют образование пор. Таким образом, условия замерзания могут быть отрегулированы в соответствии с желаемой пористостью. Держите образцы на ночь при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Отделение плесени в замороженном состоянии – очень сложный этап. Следует позаботиться о том, чтобы уменьшить контакт замороженного раствора с формой, с помощью кожи головы погрузите имплантаты в 80% предварительно охлажденный этанол для получения градиентов пористости. С помощью предварительно охлажденного скальпеля удалите все детали формы, кроме оправки, для трубчатых имплантатов и все части, кроме нижней части для имплантатов в форме диска, проведите извлечение при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение ночи.

После извлечения удалите оставшиеся детали формы и высушите имплантаты на воздухе. Для определения характеристик общей пористости структуры. Необходим анализ ртутным оксиметром.

В этом примере измерения ртутного оксиметра показывают отчетливые пики, которые соответствуют порам с обеих сторон имплантата и меньшим междисперсным порам. Однако более важными данными является разница между пористостями внутрипросветных и внесветовых поверхностей, которую можно проанализировать с помощью изображения J для распределения пор по размерам. Последующее замораживание разрушения образцов путем наблюдения за поперечным сечением с помощью сканирующего электронного микроскопа.

Благодаря открытой пористой природе используемых имплантатов и светоотражающей способности титана, в пористых имплантатах можно делать Z-стеки меченых ячеек. Клетки, помеченные PKH 26 или кальцием AM, могут быть использованы для визуализации имплантатов с помощью конфокальной лазерной микроскопии для наращивания многослойности. Высочайшая воспроизводимость достигается при использовании окунальных роботов.

Однако, если робот для погружения недоступен, эти действия можно выполнить вручную. Для приготовления коллагенового раствора используют медицинский коллаген первого типа и альгинат натрия. Оптимизированные концентрации составляют 0,5 грамма на литр на каждую в 150 миллимолярах.

Буфер из цитрата хлорида натрия при pH 3,8 растворить раствор коллагена на ночь для обеспечения однородности. Кислый pH раствора 3,8 необходим для стабильного наращивания слоев, так как структура нестабильна. Перед сшивкой.

В конструкции с нейтральным pH специальный держатель для использования имплантатов с погружными роботами используется в многослойном производстве полиэлектролита. Наносите слои на поверхность либо только титановых имплантатов, либо имплантатов, модифицированных в соответствии с описанием в тексте. С помощью роботизированной системы погружения сначала погружают имплантаты в раствор альгината на 15 минут, затем промывают конструкцию 150 миллимолярным хлоридом натрия при pH 3,8 в течение пяти минут.

Затем следует погружение в раствор коллагена на 15 минут. Чтобы стабилизировать базальную мембрану, сначала приготовьте сшивающий раствор в концентрации 100 миллимолярных генинов. В A-D-M-S-O цитратном буфере с объемным отношением от одного до четырех объемов растворите генин в компоненте ДМСО, а затем в водном компоненте во избежание слипания образцов путем погружения в сшивающий раствор в течение 12-24 часов после этого.

Промойте большим количеством цитратного буфера при pH 3,8 После промывки стерилизуйте образцы либо с помощью УФ-обработки в течение 30 минут, либо в противогрибковой ванне с антибиотиком. Основными параметрами, определяющими качество имитации базальной мембраны, являются ее толщина и диаметр волокон. Расчет диаметров волокон с помощью атомно-силовой микроскопии или FM-изображений, полученных в контактном режиме.

После сушки образцов с потоком азота, перед получением изображения, количественно определите толщину не менее 10 волокон на изображение, чтобы определить среднюю толщину волокон. С помощью программного обеспечения Image J после сушки коллагеновых альгинатных 24 бислойных коллагеновых многослойных пленок толщина пленок может быть определена с помощью испытаний на царапины. Используя ЧМ, сначала с помощью иглы шприца поцарапать пленку после локализации царапины световым микроскопом, получить изображения с помощью ЧМ на поверхностях размером 10 на 10 квадратных микрон на границе царапины.

Рассчитайте высоты по профилям, полученным с помощью программного обеспечения A FM, которое предоставляет толщину слоя пленки. После имплантации устройства в трахею кроликов, как описано в тексте, возьмите образцы крови из их ушных вен, центрифугируйте образцы при 5000 об/мин в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Для анализа используют полученную надосадочную жидкость после экстракции плазмы кролика с 0,1% триоруксусной кислоты.

Проводят обратнофазную очистку ВЭЖХ от содержимого белка плазмы путем очистки экстракта с помощью ядра клетки обратной фазы 305 С 18 колонки. Запишите поглощение на 214 и 280 нанометрах с помощью системы растворителей и скорость потока, найденные в текстовом протоколе. Соберите пиковые фракции перед их концентрированием путем выпаривания.

При использовании скоростного вакуума важно остановить скоростной вакуум до полного высыхания. Соотнесите пики, полученные в разные моменты времени в течение периода имплантации. Используйте очищенные пептиды, которые демонстрируют устойчивые тенденции в ходе имплантации, для идентификации с помощью автоматического секвенирования Эдмонда.

Загрузите образец в фильтры из стекловолокна, обработанные мозгом, определите концевую последовательность очищенных пептидов путем автоматической деградации Эдмонда с помощью профессионального микросеквенатора. Следующим этапом является идентификация фенил-й и одной аминокислот с помощью хроматографии на колонке C 18. После того, как последовательность получена, она может быть идентифицирована с помощью дробеструйного программного обеспечения с использованием базы данных Swiss Prote.

Изменяя концентрацию раствора PLLA, можно контролировать размер пор на экстралюминальной стороне имплантатов. На размер и форму пор существенно влияло наличие титановых имплантатов. Размеры пор варьировались от 40 до 100 микрометров с использованием более низких концентраций, приводящих к уменьшению пор, в то время как размер внутрипросветных боковых пор регулировался ограниченной экстракцией и составлял около девяти микрон, что меньше среднего размера фибробластов.

При добавлении этапа инкубации при комнатной температуре можно получить двойные пористые структуры, в которых пористые стенки более крупных пор имеют свою собственную пористость. Эта особенность важна для толстых имплантатов, так как она облегчает движение газов и питательных веществ. После того, как градиент пор сформирован, можно добавить слой альгинатной пленки коллагена поверх структуры.

Этот слой пленки устойчив на поверхности пены PLLA и может сохраняться на поверхности при отсутствии образования наноразмерных коллагеновых волокон пены. По мере роста слоя пленки рост пленки происходит в геометрической прогрессии. Таким образом, можно получить толстую пленку толщиной в несколько сотен нанометров.

Пористые титановые имплантаты интегрируются с тканью хозяина и полностью заполняются в течение четырех-шести недель in vivo, как показано на поперечных срезах эксплантированных имплантатов. Ткань внутри пор представляет собой зрелую соединительную ткань с хорошим уровнем васкуляризации. В течение этого периода анализ ВЭЖХ показал отчетливые пики, которые колеблются в течение времени имплантации.

Пиковые фракции, представляющие интерес, были секвенированы и определены как альфа- и бета-гемоглобиновые полуцепи, которые показали аналогичную тенденцию при показаниях С-реактивного белка. Как только вы освоите эту технику, ее можно будет выполнить за один день, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создавать 3D многомасштабные градиенты PO для модификации металлических имплантатов и для экспериментов с клеточными культурами.

Морозоизоляция и послойное образование пленки – это простые металлы для создания собственных модифицированных имплантатов или микроокружений для клеток.