Измерение силы при сжатии для оценки функции мышц в личинки данио

Общая цель этой процедуры - измерить выработку силы при максимальном сокращении рыб данио, личинок, мышц туловища. Это достигается путем изготовления шовных петель, которые будут использоваться для удержания личинок на месте во время измерения силы. Далее обезболенные личинки помещаются внутрь экспериментальной камеры.

Оказавшись на месте, сила регистрируется во время максимального сокращения при подергивании. Последним шагом является измерение размеров мускулатуры туловища, чтобы пиковая сила могла быть нормализована до площади поперечного сечения мышц. В конечном счете, измерение выработки силы во время сокращения используется для отображения изменений в мышечной функции и общем состоянии мышц.

Хотя мы демонстрируем этот метод на личинках дикого типа данио-рерио, его также можно использовать с генетически модифицированной личинкой или с личинкой, обработанной лекарствами или токсикантами. Затем метод может быть использован для характеристики моделей мышечных заболеваний и оценки методов лечения или для изучения развития мышц, травм или химической токсичности. Первым делом необходимо подготовить шовные петли, которые будут использоваться для удержания личинок на месте.

Во время силового испытания используйте щипцы, чтобы разделить нестерильный шов на три нити. После отделения начните завязывать двойной узел в одной из нитей, но остановитесь перед тем, как затянуть узел полностью, чтобы сделать небольшую петлю. Вместо этого, чтобы закончить петлю, с помощью ножниц срезайте лишний шов с хвостов.

Поместите петлю на липкую сторону стикера для последующего использования. Сделайте по две шовные петли для каждой личинки, которая будет испытываться. Во-первых, поместите испытательный аппарат на предметный столик стереомикроскопа.

Затем подключите кабели датчика силы и регулятора длины к испытательному устройству. Включите преобразователь силы и регулятор длины и щелкните переключатель на передней панели регулятора длины. Это делает длину трубки контроллера мостовой с одноразовым переносом. Пипетка.

Заполните экспериментальную камеру раствором для испытаний. С помощью щипцов подхватите шовную петлю за один из хвостов в качестве захвата. Петля на изогнутой части может перекнуть шов и привести к его разрыву во время последующих этапов.

Повесьте одну петлю на трубку датчика силы, а другую на регулятор длины С помощью одноразовой передаточной пипетки перенесите личинок рыбки данио в маленькую чашку Петри, наполненную раствором для тестирования. Как только анестетик подействует, осторожно подтолкните хвост, чтобы убедиться в отсутствии прикосновения, вызванного плаванием. Далее с помощью стеклянной пипетки перенесите личинок в экспериментальную камеру с помощью щипцов.

Аккуратно проведите переднюю часть личинки через шовную петлю на трубке датчика силы, захватывая оба хвоста шовной петли. Потяните их одновременно, чтобы затянуть петлю сзади к дубовому мешку или проткнуть плавательный пузырь щипцами. Возьмитесь за один хвост и потяните, заставляя личинки поворачиваться на 90 градусов вокруг трубки, пока боковая сторона личинки не будет обращена вверх.

С помощью позиционирующего устройства X, Y, Z, прикрепленного к контроллеру длины, переместите трубку контроллера длины вдоль оси x и под туловищем и хвостом личинок. Оставьте пространство между концами управляющей трубки по длине и трубкой преобразователя силы. Далее направьте шовную петлю над хвостом личинок и затяните шовную петлю

Как было продемонстрировано ранее, вам может потребоваться повернуть заднюю часть личинок так, чтобы боковая сторона была обращена вверх. Оказавшись на месте, обрежьте хвосты шовной петли. С помощью позиционирующих устройств XY, Z медленно опускайте трубки до тех пор, пока они не коснутся дна камеры.

Затем поднимите личинок на соответствующее расстояние от дна камеры. Это должно быть в пределах рабочего расстояния от объектива инвертированного микроскопа, используемого позже. Наконец, отрегулируйте длину трубки контроллера, чтобы выровнять длинную ось личинки с длинной осью трубки преобразователя силы.

Для начала переместите испытательный аппарат на предмет инвертированного микроскопа. Далее подключите термометр циркуляционного насоса на водяной бане и терморегулятор к испытательному аппарату. Включите необходимые компоненты и отрегулируйте настройку на регуляторе температуры до нужного значения.

Подключите кабели от стимулятора к испытательному аппарату. Включите питание на стимулятор, но не стимулируйте личинки в этот момент. Чтобы убедиться в том, что личинки расположены параллельно дну камеры, просмотрите участок личинки между концами трубок.

Если они параллельны, оба конца личинок будут в фокусе, если это необходимо. Отрегулируйте трубку преобразователя силы так, чтобы оба конца оказались в фокусе, а личинка располагалась параллельно. Включите систему длины видеосаркомера и поверните видеокамеру так, чтобы бороздки были параллельны сторонам видеокадра.

Расстояние между бороздками используется в качестве индикатора длины саркомера. Отрегулируйте микроскоп так, чтобы сфокусироваться на периферических волокнах, и обратите внимание на указанную длину саркомера. При необходимости отрегулируйте регулятор длины, чтобы укоротить личинок до тех пор, пока длина саркомера не станет меньше оптимальной.

Сначала установите выходной ток на стимуляторе на низкую магнитуду, а затем запрограммируйте специализированное программное обеспечение для подачи импульсов тока длительностью 0,2 миллисекунды. Подайте первый импульс и с помощью осциллографа измерьте пиковую силу подергивания.

Увеличьте ток с шагом 50 миллиампер и измерьте пиковую силу подергивания на каждом новом уровне тока. Подождите 30 секунд между подергиваниями, чтобы предотвратить усталость по мере увеличения тока стимуляции. Пиковая сила подергивания обычно увеличивается до максимума, а затем постепенно уменьшается ток, с которым генерирует личинка.

Наибольшая сила — это оптимальный ток стимуляции после того, как вы определили, установите амплитуду тока на оптимальный ток стимуляции и отрегулируйте длину личинок, чтобы вызвать максимальную силу подергивания. Наконец, вызовите подергивание мышц личинки. Используйте осциллограф для записи силовой реакции и сохраните запись для последующего анализа.

Чтобы измерить размеры мускулатуры, переместите испытательный аппарат обратно в стереомикроскоп. С помощью шкалы IP измерьте высоту мускулатуры, если смотреть сбоку. Снимите мерки по анатомическому ориентиру.

Например, урогенитальное отверстие отмечено здесь красным цветом. Затем следите за тем, чтобы не изменить длину личинок. Поверните личинок на 90 градусов с помощью хвостов шовной петли для того, чтобы рассмотреть личинки снизу.

Измерьте ширину мускулатуры, если смотреть снизу. Наконец, разрежьте шовные петли микролезвием, чтобы освободить личинки от испытательного оборудования у здоровых личинок дикого типа данио-рерио, мышечные волокна должны быть параллельны друг другу без больших зазоров между ними и иметь признаки бороздки дикого типа личинки данио-рерио, которые не проявляют этих особенностей или с явными повреждениями, такими как оторванные волокна, как показано здесь, должны быть отброшены здесь. Пиковая сила подергивания в зависимости от тока стимуляции построена для одной личинки данио-рерио.

Оптимальный ток стимуляции обычно составляет от 400 до 600 миллиампер. Здесь показана репрезентативная реакция силы, собранная при максимальном сокращении одной личинки. Здесь. Показано, что пиковые значения силы у личинок дикого типа разного возраста находятся в диапазоне от 0,9 до 1,7.

Милли ньютоны со старыми личинками генерируют больше силы, чем молодые личинки. Старые личинки генерируют больше силы, чем молодые, даже после того, как пиковые силы нормализуются в области поперечного сечения мышц. При попытке выполнить эту процедуру важно затянуть шовные петли настолько, чтобы личинки не могли легко вращаться вокруг датчика силы и трубок регулятора длины.

Если шовные петли слишком свободны, сила, создаваемая личинкой, не будет полностью передана преобразователю силы, и максимальная сила подергивания будет недооценена.