Синтез, Сотовый Доставка и В естественных условиях Применение датчиков рН Дендримеров основе

Общей целью данного эксперимента является разработка новых флуоресцентных сенсоров на основе барабанщиков Dun с улучшенными свойствами для визуализации pH in vitro в живых клетках и in vivo. Это достигается путем предварительного конъюгирования pH-чувствительных красителей с дендритным каркасом вместе с другими фрагментами, такими как целевые группы или pH в чувствительных красителях. А измерения in vitro проводятся для создания калибровочной кривой pH рядом с pH изображения в живых клетках.

Датчик доставляется с помощью электропорации, а карты pH генерируются с помощью конфокальной микроскопии для визуализации pH во внеклеточном пространстве мозга. Во время физиологической и патологической нервной активности датчик микроинъекционно вводится в мозг мышей, находящихся под наркозом. Затем данные флуоресценции получают с помощью двухфотонной микроскопии.

Полученные результаты показывают, что датчики на основе более глубоких датчиков успешно измеряют изменения pH с высоким пространственным и временным разрешением, как в живых клетках, так и in vivo. Несмотря на то, что уже было использовано несколько дымовых красителей с чувствительными к pH свойствами, они имеют ряд недостатков, таких как плохая подвижность и утечка клеток. Более того, они не позволяют измерить метрику сыпи в абсолютном выражении.

Здесь мы продемонстрировали концепцию pH-чувствительных красителей с генетическим каркасом D, и, поскольку характеристики позволяют проводить точные измерения со специальным временным разрешением, этот метод может быть полезным инструментом для изучения физиологических и патологических процессов, регулируемых pH в живых клетках. Нарушение регуляции pH в нервной системе связано с несколькими состояниями, такими как инсульт и эпилепсия, а имеющийся датчик pH оказался малоэффективным, что привело к разработке представленного датчика. Несмотря на то, что здесь применяется pH-визуализация, это общий подход, который может быть применен к другим биологически значимым видам.

При выборе красителя, чувствительного к прибыли, простой и универсальный синтетический подход делает эти процедуры простыми. Сегодня процедуру продемонстрируют Джованни Ре, Барбара Ти, Марко Броуди и Себастьян Сули То сопряжение индикаторов pH с Пиамом Демерсом. Начните с растворения раймера в безводном ДМСО при конечной концентрации 50 микромоляров.

Приготовьте 10 микромолярных стоковых растворов флуоресцеина NHS и тетраэтилрумина NHS, также известного как TMR в безводном растворе, DMSO в микроцентрифужной пробирке в комбинированном виде, один миллилитр раствора G четырех перам с восемью эквивалентами, или 40 микролитров флуоресцеина и восьми эквивалентов, или 40 микролитров TMR. Молярное соотношение в смеси будет отражать количество красителей, загруженных на демер. Размешайте раствор при комнатной температуре в течение 12 часов.

Далее разбавьте смесь один к 10 деионизированной водой и загрузите реакционную смесь в диализный мешок с отсечкой по молекулярной массе 10 килодальтон, диализуйте против деионизированной воды и замените воду в резервуаре три раза в течение 24 часов. На следующий день переложите раствор в стеклянный флакон и заморозьте его при температуре минус 80 на несколько часов. Когда раствор полностью замерзнет, переложите флакон в лиофилизатор и сублимационно высушите в течение 24 часов.

Следует получить порошок фиолетового цвета, волнистый получить твердое вещество и растворить его в воде mqe. При конечной концентрации 10 микромоляров. Раздайте раствор по 50 микролитров аликвот в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 миллилитра, и храните их при температуре минус 20 градусов Цельсия.

Для калибровки in vitro приготовьте 500 наномолярный раствор D-барабанщика в двухмиллимолярном PBS в кварцевом Q-ветеринарном препарате. Во избежание резких изменений pH во время титрования используется очень разбавленный буфер PBS. Измерьте спектры излучения флуоресцеина и TMR и оптимизируйте оптические настройки флуориметра для достижения хорошего соотношения сигнал/шум.

Затем выполните титрование pH, добавив небольшие объемы 0,1 нормального гидроксида натрия и 0,1 нормальной соляной кислоты. После каждого добавления встряхивайте ветеринарный препарат Q, чтобы перемешать. Подождите одну минуту для уравновешивания, а затем измерьте pH с помощью pH.

Спектры излучения микроэлектродов флуоресцеина и TMR должны регистрироваться на каждом этапе без каких-либо изменений. В оптических настройках построите график зависимости интенсивности флуоресценции от pH. Для титрования сигнал доминирования стержня не должен зависеть от pH.

Сигнал флуоресцеина должен представлять собой сигмоидальную кривую и должен быть снабжен моделью с одним связыванием с PK 6,4 для электропорации. Перенесите шесть раз по 10 на пятую хела клетки по 72 микролитра в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра к ресуспензионным клеткам. Добавьте дендри или водный раствор в концентрации два микромоляра, добавьте три миллилитра, электропориционный буфер в микропробирку для очистки.

Затем с помощью наконечника для электропорации объемом 10 микролитров отсасывайте ячейку и смеси. Затем вставьте микропипетку в пипетную станцию и установите здесь условия импульса микроочистки. Импульсное напряжение установлено на 1005 вольт.

Длительность импульса устанавливается равной 35 миллисекундам, а число импульсов устанавливается равным двум после импульсной пластины. 20 микролитров электропорации клеток помещают на стеклянное дно посуды со свежей средой без антибиотиков. Через 12 часов после электропорации визуализируют клетки с помощью конфокального микроскопа с использованием стандартного набора фильтров для флуоресцеина и r домина.

Сфокусируйтесь на образце и отрегулируйте мощность лазера и усиление детектора, чтобы максимизировать соотношение сигнал/шум. Если электропорация прошла успешно, клетки должны быть ярко флуоресцентными в обоих каналах. Локализация зависит от размера и используемого заряда D. Часто.

Солнечная лизосомальная локализация, которая проявляется в виде небольших перинуклеарных везикул, присутствует из-за эндоцитоза или компартментализации. Если преобладает лизосомальная локализация, при которой большая часть флуоресценции локализуется внутри везикул, а поровый сигнал наблюдается в цитозоле. Это указывает на токсичность, и от измерений следует отказаться.

Последовательно захватите два канала, получите несколько изображений и усредните изображения, чтобы улучшить качество изображения. Чтобы построить калибровочную кривую pH, используйте буферы с opfor при разных ph, чтобы сгруппировать внутриклеточный и внеклеточный pH на одном и том же значении. Получите не менее 20 изображений клеток на pH и измерьте не менее пяти точек от pH 5,5 до pH 7,5.

Он напоминает, что pH B six токсичен для клеток, но может переноситься в течение короткого периода времени, поэтому получайте изображения как можно быстрее. Если вы видите признаки апоптоза, выбросьте клетки и начните заново. После приобретения.

Для анализа данных используйте image J или аналогичное программное обеспечение. Во-первых, определите соотношение зеленого и красного. Затем построите график зависимости отношения от pH, чтобы получить линейный тренд, который даст калибровочную кривую, которую можно использовать для преобразования отношения в pH в будущих экспериментах.

Для подготовки образцов in vivo начните с C 57, черных, шести J и самок мышей в период между 28 и 70 днями после рождения. После обезболивания мышей уретаном выполните щипкование пальцев ног, чтобы убедиться, что животное полностью обезболилось, и нанесите глазную мазь для снижения корковой реакции на стресс и отека мозга. Во время операции внутримышечно вводят два миллиграмма на килограмм массы тела дексаметазона, фосфата натрия.

Далее с помощью хирургических ножниц побрейте голову животного, после чего наложите хирургическую простыню и нанесите на кожу головы 2,5%-ный гель с лидокаином. С помощью ножниц отрежьте лоскут кожи, покрывающий череп обоих полушарий. Промойте обнаженную кость физиологическим раствором и щипцами, аккуратно удалите надкостницу.

Это обеспечит лучшую адгезионную поверхность. Для клея и стоматологического цемента нанесите изготовленный на заказ стальной штифт с центральной камерой визуализации и с помощью цианоакрилата приклейте его на место на плоскости примерно параллельно черепу над интересующей кортикальной областью. Зафиксируйте штифт на место с помощью белого стоматологического цемента.

Зафиксируйте голову мыши и выполните трепанацию черепа диаметром два-три миллиметра путем сверления над интересующей областью. Часто на протяжении всей процедуры бурения используется шприц для нанесения свежего стерильного ликвора А на череп, чтобы свести к минимуму нагрев коры головного мозга во время операции. После трепанации черепа перенесите животное в стадию визуализации, чтобы голова оставалась неподвижной под объективом.

Прикрутите камеру визуализации к регулируемой стойке. Прикрепите изготовленную на заказ пластиковую морду, подключенную к кислороду. Это обеспечит обогащенный кислородом воздух во время эксперимента, чтобы помочь животным дышать.

Чтобы ввести датчик в кору головного мозга, загрузите стеклянную пипетку с диаметром наконечника четыре миллиметра и электрод из хлорида серебра. С помощью одномикромолярного раствора ER с одним микромоляром электрод облегчит регистрацию потенциалов внеклеточного поля с настройкой микроинжекции. Введите пипетку в кору головного мозга на глубину примерно 150 мкм.

Вводите в течение одной-двух минут под давлением 0,5 фунта на квадратный дюйм, чтобы оптимизировать оптическую установку для визуализации. Отрегулируйте мощность лазера, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание и фотоповреждение. Как правило, мощность используемого лазера составляет около 20 милливатт, а коэффициент усиления ФЭУ поддерживается постоянным на уровне 667 вольт.

Установите длину волны лазера так, чтобы возбуждать датчик на 820 нанометрах, и направьте программное обеспечение на одновременное обнаружение флуоресцеина и флуоресценции домина палочек с помощью стандартных фильтров FTSE и трит-фильтров. Также установите частоту съемки равной двум герцам для коррекции фона. Получите темный кадр с закрытым лазерным затвором, чтобы измерить средний тепловой шум, возникающий в ФЭУ и пьедестале.

Наконец, получите pH-зависимые флуоресцентные изображения и сохраните их для последующего анализа. Проанализируйте данные, как и раньше, чтобы оценить поведение флуоресцеина и рубца in vitro. Нагруженный на ример титрование по pH проводили с помощью флуориметра.

На этом рисунке показано типичное титрование датчика pH. Флуоресцеин и рубин могут возбуждаться отдельно на 488 и 550 нанометрах соответственно, что обеспечивает минимальные перекрестные помехи между двумя каналами, что хорошо видно. Флуоресцеин проявляет рН-зависимое поведение, в то время как сигнал R domine существенно не изменяется в физиологическом диапазоне рН.

Поэтому соотношение этих двух сигналов зависит не от концентрации датчика, а только от pH. Затем, чтобы доставить индикатор внутриклеточно, клетки hela были подвергнуты электропорации с помощью датчиков Дедерера и выполнена конфокальная визуализация, как описано в этом видео. Эти конфокальные изображения показывают клетки в канале флуоресцеина слева, канале R domine в центре и отображаются в виде метрической карты отношения pH справа.

Наблюдаются сильные сигналы флуоресцеина и r domine, которые совместно локализуются, демонстрируя целостность сенсорной структуры. Метрическая карта отношений восстанавливается путем деления двух изображений пиксель за пикселем и представляется с помощью псевдоцветовой шкалы. Для калибровки отклика сенсора внутри клеток было выполнено pH-зажим с помощью ионофоров, как показано здесь.

Индикаторы легко реагируют на рН с изменением соотношения зеленого к красному. Полученные данные были использованы для построения калибровочной кривой для точных измерений pH. Линейный тренд в калибровке демонстрирует способность датчика реагировать на pH без каких-либо возмущений со стороны клеточной среды.

Чтобы продемонстрировать, как датчики на основе дендри могут быть использованы для визуализации in vivo, была проведена визуализация pH в мозге дендри или мыши, которой была введена анестезия. Сигналы флуоресцеина и r domine были получены одновременно с возбуждением 820 нанометров, а карта отношений была построена на попиксельной основе, аналогично измерениям живых клеток. Примечательно, что индикаторы локализуются во внеклеточном пространстве, нефлуоресцентные участки на изображении идентифицируют клеточные тела или мелкие кровеносные сосуды для верификации реакции сенсора на pH.

Мы использовали гиперкапноэ. Действительно, известно, что углекислый газ изменяет равновесие карбонатных буферов в крови и тканях, что приводит к закислению ткани. Как видно на этом графике, вдыхания 30% углекислого газа достаточно, чтобы вызвать сильную реакцию датчика, которая полностью обратима при оборотной вентиляции мыши.

Эти результаты демонстрируют потенциал датчиков на их основе для выявления физиологических и патологических изменений pH в живых клетках и in vivo. О, наша методика совместима с другими измерениями, такими как электрофизиологические записи. Это позволило получить одновременно взаимодополняющую информацию о протекающем биологическом процессе.

Этот метод, после его разработки, проложил путь исследователям в области клеточной биологии и нейробиологии к изучению процессов, регулируемых pH в культуральных клетках и in vivo.