Всего горе иммунофлуоресцентного окрашивания новорожденных Retina мыши по расследованию ангиогенеза В естественных условиях

Общей целью этой процедуры является исследование ангиогенеза в сетчатке новорожденной мыши. Это достигается путем сначала зарождения постнатальных глаз, а затем применения фиксатора третьего шага заключается в тщательном рассечении постнатальной сетчатки мурны в форму лепестка, а заключительным этапом является окрашивание сосудистой сети сетчатки. В конечном счете, визуализация сосудистой сети сетчатки мыши достигается с помощью флуоресцентного окрашивания и конфокальной микроскопии.

Эту процедуру будут демонстрировать доктор Саймон Тло, постдок в моей лаборатории, и Кэтлин Алленсон, бывший сотрудник моей лаборатории. На протяжении всей этой процедуры по умолчанию используется комнатная температура. Начните с того, что положите гуманно убитого щенка мыши на бок с помощью ножниц.

Снимите кожу, закрывающую глаз. Затем, расположив ножницы под глазом, разрежьте зрительный нерв и окружающие ткани и приподнимите глаз. Перенесите энуклеированный глаз в 24-луночный планшет, содержащий фиксатор, который составляет 4% PFA в два раза.

PBS продолжайте препарировать следующий глаз, пока один из них находится в фиксаторе. Пошатывание между двумя рассечениями глаза составит полминуты. С практикой.

Дайте каждому глазу зафиксироваться в течение 10-15 минут. Затем переложите их в холод два раза PBS на лед не менее чем на пять-10 минут. Прежде чем изолировать сетчатку, соберите столько глаз в PBS, сколько нужно, используя пластиковую пастбищную пипетку, которая была вырезана для расширения кабана.

Перенесите глаза в чашку Петри, содержащую двукратное PBS под препарирующим микроскопом. Удалите жир вокруг глаза с помощью щипцов и ножниц. Проткните край роговицы острыми ножницами и разрежьте вокруг роговицы и радужной оболочки, выбросьте эти ткани.

Далее вставьте щипцы между сетчаткой и склерой. Удалите склеры, стараясь при этом не порвать сетчатку. Слой сосудистой оболочки также может быть удален, если нет риска повредить сетчатку.

Оставление слоя сосудистой оболочки глаза не должно существенно влиять на качество иммуноокрашивания. Теперь с помощью щипцов снимите линзу и стекловидное тело. Затем следует удаление алоидных сосудов.

С помощью тонких щипцов соберите их вместе в центре глаза. Затем быстро оттяните их в сторону от центра сетчатки. Будьте особенно осторожны, чтобы удалить весь желтый чертополох, потому что, если вы оставите несколько, они могут испортить ваши результаты стояния.

Чашеобразную сетчатку теперь следует перенести в чистую чашку Петри и промыть PBS. Теперь в сетчатку глаза. Сделайте четыре-пять радиальных разрезов, которые достигают примерно двух третей пути к центру.

Используйте пружинные ножницы, чтобы создать сетчатку в форме педали. Этот шаг требует терпения и практики для достижения совершенства. Теперь снимите большую часть PBS с помощью пастбищной пипетки.

Это сделает сетчатку плоской для глаз. Затем удалите излишки PBS с помощью небольшого кусочка впитывающей бумаги. Далее нанесите метанол минус 20 градусов по каплям на поверхность сетчатки глаза, пока она в основном не погрузится в воду, а затем обильно добавьте метанол.

Сетчатка станет белой. Этот шаг помогает зафиксировать сетчатку глаза и будет способствовать проникновению. Перенесите сетчатку в холодном состоянии метанолом в маленькую трубку.

Использование пластиковой пипетки с широким отверстием. Дайте им инкубироваться в холодном метаноле не менее 20 минут, если это необходимо, сетчатка может оставаться в метаноле при температуре минус 20 градусов в течение нескольких месяцев. Антитела используются только здесь.

Кино не может быть успешно использовано на материнской фиксированной сетчатке. В этом случае сетчатки нужно сразу приступать к иммуноокрашиванию после придания им формы лепестков. Начните с тщательного пипетирования метанола с сетчатки.

Затем быстро и мягко промойте сетчатку глаза одним PBS. Удалите PBS и покройте сетчатку 100 микролитрами раствора для химической завивки с 5% соответствующей сыворотки. Установите сетчатку на мягкое встряхивание в течение часа.

Удалите раствор для химической завивки с помощью пипетки и замените его 100 микролитрами раствора для химической завивки, содержащего первичное антитело или селектин ранее. Затем настройте сетчатку на инкубацию в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия с покачиванием на следующее утро. Промойте сетчатку глаза четыре раза в PBS TX в течение 10 минут за одно мытье.

Применяйте мягкое покачивание во время всех этапов стирки. Если первичное антитело неконъюгировано, добавьте 100 микролитров соответствующего флуоресцентного вторичного антитела, разведенного в соотношении от одного до 200 в PBS tx. Инкубируйте сетчатку в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия или в течение четырех часов при комнатной температуре с легким перемешиванием для удаления вторичного антитела.

Промойте сетчатку глаза четыре раза в PBS TX с легким покачиванием в течение 15 минут за одно мытье. Теперь приступаем к монтажу. Перенесите сетчатку на предметные стекла с помощью пластиковой пипетки с широким отверстием и удалите излишки P-B-S-T-X с помощью салфетки.

Затем вмонтируйте сетчатку в 50 микролитров пролонгированного золота и аккуратно накройте раствор покровным листом. Чтобы обеспечить длительный золотой сет, поместите предметные стекла в холодильник на ночь при температуре четыре градуса Цельсия, защищенные от света на следующий день. Продолжайте визуализацию сетчатки после рассечения.

Сетчатка должна выглядеть как плоский цветок с помощью ISO selectin B four Alexa 4 88. Эндотелиальные клетки окрашены и имеют зеленый цвет. Поддерживающие сосудистые мышечные клетки визуализировали с помощью гладкой мускулатуры Antifa, действовали в режиме низкой мощности с использованием пятикратного объектива, что позволило получить обзор сосудистой организации сетчатки с использованием различных комбинаций антител.

Эндотелиальные клетки можно увидеть с помощью иммуноокрашивания анти-CD-31, поддерживающие паразитов при визуализации с помощью антител против NG 2. В качестве альтернативы, поддерживающих паразитов окрашивали антидесмином. Окрашивание с помощью антидесмина визуализирует пальцеобразные процессы паразитов и помогает определить, тесно ли они связаны с эндотелиальными клетками.

В отличие от этого, окрашивание анти-NG two очерчивает ядра каждого паразита, что полезно при количественной оценке количества клеток паразита в сосудистой сети. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нельзя прикасаться к поверхности сетчатки и не повреждать ее инструментами для препарирования. После этой процедуры может быть выполнен другой метод, такой как окрашивание BD, чтобы исследовать пролиферацию конкретных клеток.