Прижизненные микроскопия для визуализации субклеточных структур в живых мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки

Общая цель этой процедуры заключается в визуализации субклеточных структур в слюнных железах мышей. Это достигается путем хирургического обнажения слюнных желез без их повреждения. На втором этапе животное, находящееся под наркозом, обездвиживается на предметном столике микроскопа.

Далее слюнные железы тщательно располагаются, чтобы не нарушить их функцию на заключительном этапе. Мышь стабилизируется с помощью специального держателя, чтобы свести к минимуму любые артефакты движения из-за сердцебиения или дыхания животного. В конечном счете, динамика субклеточных структур может быть визуализирована с помощью внутрижизненной микроскопии.

Перед анестезией взвесьте мышей, чтобы определить правильную дозу анестетика. Затем индуцируйте предварительную анестезию путем ингаляции изофтора. Как только животные потеряют сознание, подтверждайте седативные препараты каждые 15 минут и держите мышей под тепловой лампой в течение всей операции.

Следите за температурой тела животных с помощью ректального зондового термометра. Теперь выбрейте шею мыши с помощью пары электрических машинок для стрижки, а затем используйте марлевую губку, смоченную этанолом, чтобы протереть брюшную сторону шеи, высушив излишки спирта салфеткой. Затем с помощью пары тупого изогнутого пинцета приподнимите небольшой кусочек кожи на нижнем конце мышц массажиста и сделайте небольшой разрез.

Вставьте ножницы в разрез, направив кончики вверх к нижней стороне кожи и несколько раз раскрыв лезвия, пока кожа не отделится от подлежащих тканей. Затем начинается у основания слюнных желез, где нервный проток и кровеносные сосуды соединяют железу с остальным телом. С помощью ножниц отрежьте полоску отслоившейся кожи шириной три миллиметра и длиной 10 миллиметров.

После очистки области раны образовавшееся отверстие будет иметь овальную форму и иметь размеры примерно восемь на 12 миллиметров. Будут видны обе слюнные железы. С помощью шприца нанесите гель для оптической муфты в середину разреза, а затем с помощью свежих кусочков стерильной марли протрите гель по направлению к внешней стороне отверстия, пока вся кровь и выпавшие волосы не будут удалены.

Теперь используйте пинцет номер семь, чтобы найти кончик правой слюнной железы, захватывая соединительную ткань на несколько миллиметров выше верхней части железы. Затем порвите соединительную ткань вокруг железы, не травмируя паренхиму. Как только железа обнажится, аккуратно отделите соединительную ткань от железы, смывая кровотечение физиологическим раствором.

Убедитесь, что все соединительные ткани разделены и железа полностью обнажена. Перед тем, как поднести животное к микроскопу, положите на предметное столико толстый кусок марли и термопакет, накрыв верхнюю часть термопакета тонким куском марли. Поместите чехол в центр сцены.

Затем расположите мышь на правом боку поверх марли, закрепив животное куском малярного скотча на брюшной стороне передней правой лапы и шелковым швом, зацепленным вокруг резцов. Создайте некоторое натяжение между нитью и лапой и прикрепите их к сцене. При большем количестве малярного скотча слюнная железа должна отдыхать естественным образом.

В середину крышки накладывайте. Используйте пластиковые клинья, соединенные с предметным столиком микроскопа, чтобы еще больше стабилизировать голову и грудную клетку мыши. Затем поместите небольшой кусочек салфетки для чистки линз на железу.

Немного растяните сальник и поместите специальный держатель над сальником. Затем плотно присоедините стабилизатор к сцене металлическим зажимом и малярным скотчем. Накройте животное марлей и грелкой и следите за температурой обнаженных желез с помощью гибкого термосвязанного зонда, оснащенного термометром Сразу после стабилизации животного используйте эпифлуоресцентное освещение, чтобы сфокусироваться на поверхности железы.

Оцените кровоток в капиллярах и общую морфологию тканей. Чтобы возбудить ген GFP, используют лазер с яркостью 488 нанометров. Установите пиковую мощность на 0,5 милливатт, чтобы избежать фотообесцвечивания для тандемного томатного белка.

Используйте лазер с яркостью 561 нанометр, установив пиковую мощность на уровне одного милливатта. Теперь оцените стабильность ткани, предварительно просканировав выбранный участок. Если препарат нестабилен, отрегулируйте животное соответствующим образом, чтобы найти подходящую фокальную плоскость.

В предварительном режиме. Постепенно перемещайте объектив в сторону покровного стекла до тех пор, пока не станут отчетливо видны азерные структуры, секреторные гранулы и плазматическая мембрана. Затем для отображения динамики секреторных гранул используйте скорость сканирования от 0,5 до двух секунд на кадр и 256 на 256 пикселей с пространственным масштабом 0,2 микрометра на пиксель

Чтобы оптимально визуализировать гранулы и плазматическую мембрану, установите оптическую толщину в диапазоне от 0,9 до 1,2 микрометра. Затем запишите изображение поля зрения, которое будет использоваться в качестве точки отсчета. Наконец, стимулируйте экзоцитоз путем подкожного введения 0,1 миллиграмм на килограмм свежеприготовленного изопротеренола и физиологического раствора.

Через минуту после инъекции. Слияние секреторных гранул с плазматической мембраной будет обнаруживаться по увеличению флуоресценции GFP вокруг гранул и диффузии тандемного томатного пептида в их ограничивающие мембраны. У томатной мыши GFPM азинины проявляются в виде четко различимых структур, которые экспрессируют цитозольный GFP и мембранный таргетированный тандемный томатный пептид, на что указывают ломаные линии.

В отдельных азининовых азерных клетках очерчены тандемным томатным пептидом, как показано стрелками. GFP также обнаруживается в ядрах, которые хорошо видны внутри азерных клеток. Цитозольная GFP, обозначенная стрелкой, исключена из секреторных гранул, которые проявляются в виде темных круглых пузырьков диаметром примерно от одного до 1,5 микрометров.

Для визуализации экзофитных событий после введения изопротеренола показывается репрезентативная область плазматической мембраны, обогащенная секреторными гранулами, как указано звездочкой. Может наблюдаться увеличение уровней флуоресценции GFP, обозначенных зелеными стрелками вокруг некоторых секреторных гранул, которые находятся в непосредственной близости от плазматической мембраны. Кроме того, после слияния с плазматической мембраной тандемный томатный пептид диффундирует в ограничивающие мембраны секреторных гранул, как выделено красными стрелками.

Через 30-40 секунд гранулы секретаря постепенно разрушаются, и их ограничивающие мембраны интегрируются в апикальную плазматическую мембрану. Представленный здесь подход представляет собой крупный прорыв в клеточной биологии, поскольку он позволяет визуализировать динамику специфического процесса мембранного транспорта у живых мышей.