Прочная 3D рыбу ДНК с использованием меченых зондов непосредственно

Общая цель данного эксперимента заключается в тщательном исследовании пространственной организации специфических геномных локусов в отдельных клетках. Это достигается путем создания флуоресцентно меченых зондов для окончательного связывания и выделения интересующей области генома. Следующими шагами являются приклеивание, фиксация и проникновение интересующих клеток на предметное стекло, чтобы обеспечить доступ зонда.

Затем следует одновременная термическая денатурация зонда и клеточной ДНК с последующей гибридизацией зонда в течение ночи для удаления неспецифически связанного зонда и противостояния с dpi. Визуализация ядра клетки: результаты, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, в конечном итоге позволят выявить положение ядра, занимаемое конкретными участками генома. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ядерной организации, такие как определение функциональных взаимодействий между генами.

Основное преимущество этого конкретного протокола DNA FISH заключается в том, что он быстрый, надежный и универсальный. Хотя мы демонстрируем этот метод с использованием E-Es ячеек, он также может быть применен ко многим другим типам клеток, зондам с прямой маркировкой, изготовленных из задних панелей от 100 до 250. Килобазы стабильно выдают яркие сигналы, если требуются пробники меньшего размера.

Используйте смид с концентрацией от 40 до 50 килооснований или даже плазмиды, содержащие вставки от 5 до 10 килооснований. Идентификация спинных или средних клонов, соответствующих определенным генам, с помощью ансамбля или браузеров генома UCSC. Для получения высококачественной обратной ДНК используют либо повторное осаждение, либо коммерчески доступный набор, чистота препарата пропорциональна требуемому объему зонда.

Выполните маркировку в два этапа. Во-первых, используйте трансляцию NIC для введения аминоаллеля, DUTP. Во-вторых, используйте химическую связь для присоединения среднестатистического реакционноспособного красителя.

Стоит потратить время на изготовление ярких зондов, так как они имеют решающее значение для сильных сигналов рыбы. Эта процедура может быть выполнена параллельно с обработкой клеток и не обязательно должна проводиться в начале дня. Сначала смешал от 10 до 20 нанограммов непосредственно меченого зонда с шестью микролитрами CO 1D NA в течение шести микрограммов.

Затем добавьте один микролитр одноцепочечной ДНК из семенников лосося на 9,7 микрограмма. Отрегулируйте объем смеси до 100 микролитров с водой. Далее добавьте 10 микролитров трехмолярного ацетата натрия и 275 микролитров этанола и перемешайте путем вортексирования.

Дайте смеси выпасть в осадок не менее одного часа при температуре минус 20 градусов Цельсия. Далее раскрутите осадки в микрофуге на максимальной скорости в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Затем промойте гранулу с 70% этанолом и снова уменьшите ее в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Далее высушите гранулу на воздухе. Затем ресус. Суспензируйте его в пяти микролитрах деионизированной формы.

Амид при 37 градусах Цельсия во время встряхивания при 1000 об/мин вы обрабатываете фольгу, чтобы защитить его от света. Через 30 минут добавьте пять микролитров смеси сульфата декстрина и продолжайте инкубацию с перемешиванием. В течение еще 10 минут склонность клеток к прилипанию к слайду сильно варьируется в зависимости от типа клетки.

Для каждого типа ячеек определите оптимальное время оседания и плотность ячеек опытным путем. Для получения стабильных результатов клетки должны находиться в одноклеточной суспензии Чтобы прикрепить ES-клетки мыши к предметному стеклу. Начните с обведения области на предметном стекле, где будут обнаружены клетки.

С помощью гидрофобной ручки приготовьте суспензию из расчета от 20 до 50 000 клеток на 80 до 100 микролитров в обычной питательной среде, добавьте клеточную суспензию в круг и дайте клеткам прикрепиться около трех часов в увлажненном инкубаторе. После установки предметного стекла зафиксируйте ячейки, аккуратно погрузив предметное стекло в 4% PFA на 10 минут. Предметное стекло должно быть плоским в лотке, как коробка для чаевых.

Использование реактивов комнатной температуры в банках коплана. Сначала погасите клетки хлоридом триса в течение 10 минут. Во-вторых, пропитайте клетки смесью сапина и тритона X 100 в течение 10 минут.

Теперь дважды промойте ячейки в PBS по пять минут за одну промывку. После промывки инкубируйте клетки в 20% глицерине не менее 20 минут. На этом этапе предметные стекла могут храниться в 50% глицерине при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение нескольких недель.

Хранение в течение суток и более должно увеличить мощность сигнала. Обязательно уравновесьте клетки до комнатной температуры в 20% глицерина в PBS, прежде чем продолжить. Теперь заморозьте и разморозьте предметное стекло три раза, используя жидкий азот.

По одной горке за раз, когда потрескивающий звук прекращается. Через несколько секунд снимите предметное стекло на бумажное полотенце для размораживания, подождите, пока непрозрачный замерзший глицерин исчезнет, прежде чем снова заморозить предметное стекло, можно удобно сделать до 15 слайдов по очереди в течение трех циклов замораживания. Теперь дважды промойте слайды в PBS по пять минут за одну стирку.

Затем инкубируйте горки в 0,1 молярной соляной кислоте в течение 30 минут. После обработки соляной кислотой следует еще одна пятиминутная промывка в PBS. Теперь снова пропитайте клетки более сильным сапином и перемешайте Triton X 100 в течение 30 минут, чтобы смыть поверхностно-активные вещества со стекол, используйте две пятиминутные промывки PBS.

Теперь слайды готовы к балансировке в 50% форме амида в XSSC. Это должно продолжаться не менее 10 минут, при этом уравновешивание извлекать зонд несколько раз вверх и вниз, а затем переливать 10 микролитров на ячейку соответствующего размера. Снимите предметное стекло с формы амидом и вытрите лишнюю жидкость вокруг клеток бумажным полотенцем, но не допускайте пересыхания клеточного пятна.

Теперь переверните крышку. Наденьте на горку над клетками. Приклейте защитное стекло к предметному стеклу резиновым цементом.

Дайте цементу полностью высохнуть и защитите предметное стекло от света. Далее нагрейте горки до 78 градусов Цельсия ровно две минуты на горячей плите. Это очень важно для правильной работы.

Чехол должен защищать клетки от света на этом этапе, чтобы максимально сохранить ядерную морфологию. Очень важно не допускать пересыхания клеток и следить за тем, чтобы тепло имело правильную температуру. Затем поместите предметные стекла в легкую плотную коробку с влажными бумажными полотенцами, чтобы обеспечить влажность, и выдержите в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию.

Начните эту процедуру с отклеивания резинового цемента вокруг покровных стеблей. Затем поместите каждую заслонку в X excess SC до тех пор, пока крышка не ослабнет и не соскользнет. Затем промойте предметные стекла в 50%-ной форме амида в двух лишних количествах SC в течение 15 минут при температуре 45 градусов Цельсия.

Держите на водяной бане крышку, чтобы защитить их от света. Затем промойте слайды в 0,2 XSSC в течение 15 минут при температуре 63 градуса Цельсия. Затем два XSSC в течение пяти минут при 45 градусах Цельсия, и, наконец, до превышения SE при комнатной температуре в течение пяти минут.

Остальные шаги выполняются при комнатной температуре, начиная с пятиминутной стирки, и PBS теперь окрашивает слайды лапкой в течение двух минут, а затем задерживает слайды PBS на пять минут. Чтобы установить защитное стекло, нанесите 10 микролитров монтажного материала на каждое место ячейки на защитное стекло подходящего размера. Затем высушите излишки PBS вокруг места клетки, не давая клеткам высохнуть.

Переверните крышку, наденьте на предметную горку и заклейте ее лаком для ногтей по протоколу подготовки рыбного щупа. После трансляции NIC должен быть виден мазок ДНК, основная масса фрагментов которого находится от 150 до 700 пар оснований. После химического связывания включение флуоресцентного красителя может быть измерено с помощью спектроскопического анализа прохождения зонда.

Эти шаги по контролю качества для оценки качества датчика имеют решающее значение при использовании такого датчика. Автоматизированная визуализация с помощью эпифлуоресцентного микроскопа оказалась возможной. Для этого требуются четкие, легко идентифицируемые сигналы рыб с небольшим фоном.

Это необработанное изображение поля зрения. На следующих изображениях представлены ядра, которые были идентифицированы и проанализированы автоматически. Различные межаллельные и межлокусные расстояния показаны вверху справа и по обе стороны от каждого ядра.

При таком увеличении белые пятна представляют собой идентифицированные ядра в поле зрения. Эти гистограммы показывают максимальные межаллельные расстояния между зелеными сигналами вверху и красными сигналами внизу. Все данные получены от зародышевых клеток P 20 с зондами, расположенными на разных хромосомах, охватывающих гены HBB и HBA и кластер гистонов.

Это примеры ядра печени плода, окрашенных задними зондами, охватывающими mic и гены KC и Q1. Из этих изображений можно получить ядерные координаты сигналов рыб и вычислить пространственные отношения областей генома. Межаллельные расстояния отображаются как доля радиуса ядра.

В этих данных красные зонды были значительно ближе друг к другу, чем зеленые. Также была возможна конфокальная микроскопия, которая требует более интенсивных сигналов. Стеки изображений использовались для 3D-моделирования сигналов рыб в пределах их хромосомных территорий.

Эти два зонда, выделенные красным и белым цветом, находятся близко к обоим концам хромосомы мыши, целая краска показана зеленым цветом. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять ДНК рыб, чтобы исследовать пространственное позиционирование конкретных геномных локусов в отдельных клетках. При проведении этой процедуры важно помнить, что любое лечение может повлиять на ядерную архитектуру, и важно включить соответствующее следование этой процедуре.

Другие методы, такие как иммуноферментные рыбы, могут быть применены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как пространственные отношения между генами и белками.